Chocho

 

Inducción de mutantes con MSE y cruzamiento de Lupinus mutabilis M3 x Lupinus exaltatus para la obtención de segregantes con bajos niveles de alcaloides

 Charlie Andrade ¹, Vladimir Cali ¹, Karem Escobar ¹, Anabel González ¹, y Gina Velastegui ¹ 

1 Estudiantes de pregrado de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador

 

1.    INTRODUCCIÓN 

El chocho es una leguminosa importante para la alimentación andina ecuatoriana de los pequeños y medianos agricultores, debido a que contiene altos contenidos de proteína 50%, grasas no saturadas 20.4%, además vitaminas (niacina y tiamina) y minerales como calcio, fosforo y hierro (Hatzold, Elmadfa, & Gross, 1983; Yumbla, 2006). 

El chocho tiene semilla amarga debido a la presencia de alcaloides quinolizidinicos, que le confiere cierto grado toxico limitando el aprovechamiento de este grano. La biosíntesis de estos alcaloides se da por la respuesta a la acumulación de ácido jasmónico (JA), estas sustancias protegen a la planta imposibilitando su consumo sin antes ser tratada, actualmente se puede realizar desamargado con sucesivos lavados o procesos tecnológicos que eliminen estas sustancias permitiendo su consumo (Jacobsen & Mujica, 2006).   

El 95 % de la producción se encuentra en las provincias de Chimborazo, Cotopaxi, Pichincha e Imbabura se da a través de intermediarios o acopiadores y el 5% restante directamente al consumidor (Yumbla, 2006).  

Las variedades cultivadas en la Sierra ecuatoriana o región andina son: INIAP 450 Andino e INIAP 451 Guaranguito con altos contenidos de alcaloides (3.26 %) por el contrario, las especies de tarwin silvestres acumulan niveles más bajos de alcaloides como, por ejemplo, Lupinus exaltatus que es una variedad silvestre que contiene un (2.1%) de alcaloides. 

La obtención de material genético de L. mutabilis con bajos contenidos de alcaloides ha sido el objetivo de varios programas de mejoramiento. Este estudio se llevará cabo con el fin de reducir el contenido de alcaloides en las semilas de la variedad INIAP450 por el método de inducción de mutantes con Metasulfonato de etilo (MSE) y cruzamientos interespecíficos entre dos variedades seleccionadas, L. mutabilis INIAP 450 Andino, que tiene un contenido de alcaloides de 3. 92% con rendimientos altos y L. exaltatus que es usada como forraje, y según análisis revelan alto contenido de proteína en la semilla con niveles de alcaloides de 1.95% que pueden servir para futuros mejoramientos genéticos.

2.    OBJETIVOS 

2.1  Objetivo general: 

Obtener variedades de chocho (Lupinus mutabilis var. INIAP450 Andino) con bajos niveles de alcaloides.  

2.2  Objetivos específicos: 

Inducir mutantes de L. mutabilis (INIAP 450 Andino) con MSE 0.04 M

Realizar cruzamiento por el método de emasculación y fecundación para obtener segregantes, resultados de los progenitores de L. mutabilis (INIAP 450) M3 y L. exaltatus (silvestre). 

Determinar el porcentaje de alcaloides de los segregantes obtenidos por el método de Von Bae y seleccionar los segregantes con niveles bajos de alcaloides. 

 

3.    PROBLEMA DE ESTUDIO  

Bajar los alcaloides lleva varios problemas como en la parte nutricional disminuiría la proteína, porque al desamargar las semillas de chocho, residuos de los alcaloides pasan a formar parte de la proteína, y así aumentan su valor nutricional (Jacobsen & Mujica, 2006). En la parte fisiológica de la planta la formación de estos compuestos está presente desde su desarrollo hasta la fructificación, teniendo defensa propia, pero al llegar a la senescencia la familia de Lupinus envía los alcaloides a sus semillas para protección de su progenie (López, Macías, & Pérez, 2006).  

   La formación de los alcaloides es estimulada por factores externos que simulan el ataque de insectos, esto activa el mecanismo de defensa que es el ácido jasmónico. En su ruta metabólica activa el gen que se encuentra en el Loci 5 y empieza la traducción y transcripción de estos compuestos, entendido esto, al quitar eliminar esta se pierde la defensa natural de la planta contra plagas por lo cual no saldría favorable para el agricultor (Caicedo, Murillo, Pinzón, Peralta, & Rivera, 1992) 

  En el método de mejoramiento por selección escogen las mejores variedades en cada generación que tenga buen rendimiento y un nivel apto de alcaloides tratando de bajarlos cada vez más, sin embargo, llegan hasta un límite en una especie, debido, a la genética de la planta, este método lo hicieron en el L. mutabilis INIAP 450 (Williams & Harrison, 1982).  

4.    HIPÓTESIS 

¿Se podrá obtener segregantes con niveles inferiores de alcaloides a 3,92% utilizando el método de inducción de mutantes con (MSE) en INIAP450, con la intervención de un cruzamiento por el método de emasculación y fecundación en Lupinus mutabilis M3 y Lupinus exaltatus? 

5.    MARCO TEÓRICO  

5.1  Cultivo de Lupinus para su consumo 

 

El cultivo de Lupinus mutabilis es altamente comercializado en la región andina, presenta un alto contenido de proteína, aceite y nutrientes que le hace apetecible para el consumidor, no es un cultivo exigente por lo que no requiere una inversión alta y se adapta, incluso, a suelos arenosos y erosionados. Otra ventaja que tiene es la simbiosis con los rizomas que forma nódulos en las raíces por lo cual, fija nitrógeno al suelo (Márquez, 2016). 

5.2  Alcaloides en la planta Lupinus 

Los alcaloides son metabolitos secundarios sintetizados por las plantas, a partir de aminoácidos, que tienen en común su hidrosolubilidad a pH ácido y su solubilidad en solventes orgánicos a pH alcalino (Cloroformo, éter, alcohol, entre otros.). En el chocho se encuentran los alcaloides quinolizidina que proviene de la lisina y se pueden dividir en lupanina, cistsina y esparteína (Villacrés, et al, 2009). Existen formas de bajar el contenido de los alcaloides, que va desde procesos tecnológicos que resultan enérgicos o por métodos costosos, e incluso, esfuerzos de domesticación que va dirigida a bajar, seleccionar y producir variedades no amargas de chocho.

5.3  Función de los alcaloides en la planta Lupinus 

La semilla de Lupinus tiene una gran cantidad de alcaloides que varía de 0,02 a 4,45%, mediante la presencia de estos alcaloides la planta se protege de herbívoros, y en caso de condiciones extremas, brinda nutrientes para la germinación. Siendo la lupanina el más predominante, con una proporción de 1-4% cuando el grano es recién cosechado generando el sabor amargo (Villacres, et al, 2009). Los alcaloides están localizados en los tejidos periféricos de los diferentes órganos de la planta, como son: semillas, corteza del tallo, raíz o fruto y en la epidermis de la hoja, cumpliendo una importante función de protección para las plantas por su sabor amargo, reduciendo el ataque de insectos (Fernández, 2017). 

    En estudios realizados con espectrometría en el chocho, ha demostrado que la presencia de JA y alcaloides, se debe a la inducción por el ambiente y daños mecánicos o heridas que simulan un evento herbívoro (Wink, 1983). La transmisión y traducción de los alcaloides se encuentran reguladas por fitohormonas tales como el Ácido Salicílico (SA), Ácido Jasmónico (JA) y Etileno (ET), que intervienen en las rutas metabólicas vegetales que desencadenan la expresión de genes de defensa (Erazo, 2019) 

5.4  Fitomejoramiento en L.mutabilis para bajar el nivel de alcaloides

El desafío es obtener variedades resistentes a las plagas y enfermedades con bajos niveles de alcaloides. Por tanto, la domesticación deberá dirigirse hacia la selección de las variedades que almacenan alcaloides en sus tejidos a excepción de la semilla o la selección de variedades con metabolitos secundarios adicionales que estén involucrados en la resistencia (Peralta, et al, 2015). 

Las variedades con bajo contenido de alcaloides se han obtenido por dos caminos: 

1. La selección y evaluación de líneas inducidas con bajos contenidos de alcaloides (Gross, 1982). 

2. La selección de líneas espontaneas con bajo contenido de alcaloides, según Gross y Von Baer (1977), se inicia con una selección masal de una mezcla de los individuos promisorios identificados, después se realiza una selección individual para tener individuos con bajos contenidos de alcaloides y cruzándoles para obtener la siguiente generación, esto se va repitiendo por varias generaciones, llegado un punto, donde no se obtiene avance, siempre se va haciendo las cruzas entre variedades más significativas de la descendencia. 

5.5  Inducción de mutaciones para bajar el contenido de alcaloides  

Para inducir a estas mutaciones se usa el MSE (metasulfonato de etilo). Su mecanismo de acción se debe al grupo etilo presente en su estructura, que, debido a su actividad alcalina, elimina el nitrógeno de la guanina, determinando un cambio en la secuencia de las bases y eso hace que no se aparea con la citosina provocando la transición GC > AT (Delgado, 1970).  

Cuadro 1. Evidencias del mejoramiento de Lupinus 

1.    MATERIALES Y MÉTODOS

1.1  Material

Se conseguirá 150 semillas de calidad de cada variedad obtenida de los bancos de germoplasma. Las características de las variedades se mencionan en el Cuadro 2.

Cuadro 2. Características de sector donde se realizará la investigación

Lupinus mutabilis INIAP 450 andino	Lupinus exaltatus
Las semillas de L. mutabilis INIAP 450 van a ser conseguidas de la Estación Experimental Santa Catalina ubicada en la provincia de Pichincha. En el sector Cutuglahua. Características Alcaloides 3,92%Número de vainas en el eje central 10 a 14 Susceptible a plagas y enfermedades foliares y radiculares Cant. De semilla por ha: 60-80kg de semilla (1-2qq).	Las semillas de L. exaltatus van a ser conseguidas en el Colegio de Postgraduados, Montecillo, Estado de México. Características Alcaloides 1,95% Resistente a plagas y enfermedades foliares y radiculares

1.1  Modelo del diseño

La metodología experimental de la investigación consistió en 8 fases descrito en el Cuadro 3 y se procedió de la siguiente manera:

Cuadro 3. Esquema de Mejoramiento Genético por inducción de mutantes y cruzamientos interespecíficos.

Fase	Generación	Observaciones
I		Semillas de L.mutabilis INIAP450 sometidas mutágeno MSE 0.04 M por 12h. Selección por aspectos agronómicos y niveles de alcaloides en tallos, hojas. En fase de cosecha. Crianza hasta la obtención de semillas para la generación (M1)
II	M1 hasta el M3	Plantas desarrolladas a partir de semillas tratadas con MSE, mediante propagación vegetativa. Selección por aspectos agronómicos y niveles de alcaloides en tallos, hojas. Para que se auto fecunde así mismo para estabilizar la mutación. En fase de cosecha. Obtención de semillas para la generación (M2) y después (M3).
III	M3 x L. exaltatus	La población (M3) ya crecida. Se selecciona los progenitores para realizar los cruzamientos M3 (A) Recurrente x Donante L. exaltatus (B) para obtener semillas F1.
IV	F1 x M3	Las semillas sembradas se les cultiva y en floración se realiza un Retrocruzamiento con el recurrente (M3). Para obtención de semilla (Bc-1)
V	BC-1 x M3 hasta el BC-7	Primera generación de (BC-1), desechar los individuos con alto contenido de alcaloides > 2 % (2 g/100g) en las hojas en la fase floración.  Retrocruzamiento recurrente. BC1 se cruza con M3 para obtención de semilla.  Continuar con hasta BC-7. Reducción del Genoma del donante B
VI	BC-7 x BC-7	Autofecundación, selección de individuos con contenido de alcaloides < 3.5 % en semillas (Método de Von Baer). Banco de Germoplasma para futuras mejoras.

1.1       Fase I

Se colectará 150 semillas de L.mutabilis INIAP450 del banco de germoplasma y se distribuirá 50 semillas en tres camas.

1.1.1       Tratamientos de semillas de Lupinus mutabilis tratadas con meta sulfonato de etilo

Se prepararon concentraciones del reactivo MSE (C3 H8O3 S) con 0,04 M para tratar 150 semillas L.mutabilis (INIAP 450). El MSE es un agente alquilante con una eficacia mutagénica, demostrada en varios organismos experimentales.

Las semillas fueron sumergidas en el tratamiento por 12 horas, en una cámara de extracción por el riesgo toxicológico que enfrenta su uso. Después de este tiempo, se filtró con una membrana de 0.45 µm retirando la solución contenía de MSE para desechar según el protocolo de seguridad. Luego las semillas se sumergieron en agua del grifo para su posterior siembra en campo.

Cuadro 4. Manejo de cultivo de chocho.

Preparación del suelo

Rastrado, arado y surcado con tractor con una aplicación de 4 toneladas de estiércol/ha.

Siembra

Distancia entre surcos 60 u 80 cm, distancia entre sitios 30 cm, numero de semillas por sitio 3, cantidad de semilla/ ha 53 a 40kh/ha.

Fertilización

Se utiliza 30 a 60 kg/ha de P2O5 (Fósforo) al momento de la siembra se incorporación de 65 a 130 kg/ha de 18-46-00 y una aplicación foliar con 2 kg/ha de Librel-BMX.

Deshierbe

Se lo realiza a los 45 o 60 días eliminando malezas contribuyendo a la aireación del suelo y evitando el volcamiento de las mismas.

1.1.1       Selección de plantas

Se seleccionará las plantas con vigor (Bueno), inflorescencia (Bueno), Número de vainas (bueno), número de semillas por vaina (bueno) descrito en él Cuadro 5 y con contenido de alcaloides (Bajos) en las hojas Cuadro 6.

Para medir el número de alcaloides se tomará una muestra representativa del 5% de las plantas con las características antes dichas en estado de cosecha y con los parámetros anteriormente dichos y se cuantificará los alcaloides en las hojas. La determinación de alcaloides en chocho se efectuará por volumetría. El proceso se explica en el Cuadro 7.

Posteriormente se etiquetará con una cinta roja (no aceptadas) y azul (aceptadas) para conseguir semilla (M1) para pasar a la Fase II.

Cuadro 5. Características para la selección de las plantas.

	Malo	Medio	Bueno
Vigor	Tallos débiles, hojas amarillentas	Semi caída y semifrondosa	Verde y frondosa
Largo de la Inflorescencia	7 cm	14 cm	28 cm
Número de vainas por planta	0 a 7	8 a 19	20 a 28
Número de semilla por vainas	0 a 3	4 - 5	6 a 8
Resistencia a plagas	Susceptible	Ligeramente tolerante	Tolerante

Cuadro 6. Clasificación del chocho según su porcentaje de alcaloides en hojas.

Chocho amargo (alto) %	Chocho Dulce (bajo) %
> 2	< 2

Cuadro 7. Extracción de alcaloides quinolizidínicos y su cuantificación relativa mediante el método de Von Baer

Semillas	Planta
Las semillas se molarán y tamizarán apartarte un tubo cónico de centrifuga. Se pesará 0.2 g de muestra molida. A continuación, se agregará 0.6 g de óxido de aluminio y 0.2 mL de KOH al 15%, los cuales se mezclarán para obtener una pasta homogénea. Seguidamente se agregará 6 mL de cloroformo los cuales se centrifugarán por 10 minutos en una centrifugadora International Centrifuge a 350 revoluciones por minuto. Luego se recibirá la fase clorofórmica en vasos de precipitación de 50 mL, provistos de embudos con algodón en la base del cono. Se repetirá las extracciones aproximadamente 10 veces, se recogerá los lavados y se procederá a evaporarlos con calor suave (40ºC) sin llegar a sequedad, dejando en la etapa final 1 mL. Después, de que haya desaparecido el 1 mL de los lavados, se agregara 5 mL de H2SO4 0.01 N y dos gotas de rojo de metilo, se titulara el exceso de ácido con NaOH 0.01 N.	Las semillas se molarán y tamizarán apartarte un tubo cónico de centrífuga. Se pesará 0.2 g de muestra molida. A continuación, se agregará 0.6 g de óxido de aluminio y 0.2 mL de KOH al 15%, los cuales se mezclarán para obtener una pasta homogénea. Seguidamente se agregará 6 mL de cloroformo los cuales se centrifugarán por 10 minutos en una centrifugadora International Centrifuge a 350 revoluciones por minuto. Luego se recibirá la fase clorofórmica en vasos de precipitación de 50 mL, provistos de embudos con algodón en la base del cono. Se repetirá las extracciones aproximadamente 10 veces, se recogerá los lavados y se procederá a evaporarlos con calor suave (40ºC) sin llegar a sequedad, dejando en la etapa final 1 mL.
% 𝐴𝑙𝑐𝑎𝑙𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠   =    𝑚𝐿 𝑁𝑎𝑂𝐻 0.01𝑁 𝑥 0.01𝑁𝑥248𝑔/Pm mL NaOH = Volumen gastado de titulante 0.01N = Concentración exacta de NaOH 248g = Peso molecular de la lupanina Pm = Peso de muestra (g)

1.1  Fase II generación (M1) hasta (M3)

De las semillas M1 obtenidas de la Fase I se escogen 150 semillas y se siembran distribuidas 50 semillas en cada cama.

Para los cuidados de las plantas hasta la floración esta descrito en Cuadro 4. Para la selección de las plantas se sigue en mismo proceso descrito en la sección 6.3.2.

Posteriormente se etiquetará con una cinta roja (no aceptadas) y azul (aceptabas) para conseguir semilla (M2) y se realiza todo el proceso antes dicho hasta obtener el (M3) para estabilizar a mutación.

1.2  Fase III M3 x L. exaltatus

De las semillas (M3) obtenidas de la Fase II se escogen 150 semillas y se siembran distribuidas 50 semillas en cada cama, paralelamente en invernadero se sembrará las semillas de L. exaltatus para que coincida el estado fenológico de floración con el (M3).

Para los cuidados de las plantas hasta la floración esta descrito en Cuadro 4. Se seleccionarán siguiendo el criterio de la sección 6.3.2. Posteriormente se etiquetará con una cinta roja (no aceptadas) y azul (aceptabas) a las plantas de L. exaltatus para la obtención de polen y L mutabilis que van a ser emasculadas y fecundadas. El proceso de emasculación y fecundación se explica en el Cuadro 9. Después del cruzamiento, se espera hasta la formación de las vainas y se cosechará las vainas para obtener semillas F1 del cruzamiento de M3 x L.exaltatus. Con la F1 se pasa a la Fase IV.

Cuadro 9. Realización de los cruzamientos

Emasculación

Fecundación

Elección de una inflorescencia fuerte y sana de 15 o más flores. Eliminación de aquellas flores cuyos estambres ya están maduros, es decir presentan polen de color naranja. Eliminación de las flores o yemas que aún no se han desplegado. Por inflorescencia se pueden mantener 5 a 10 flores, cuyos estambres aun estén verde-claro, sin polen maduro. En las flores elegidas, se procede a realizar un corte basal en la quilla mediante la punta de una pinza. Eliminación de los estambres a través del corte anterior mediante pinzas, tratando de no dañar el pistilo y eliminando todo residuo de estambre. La inflorescencia emasculada se cubre mediante una bolsa de papel grasa o emasculada, anotándose en ella el número de la combinación y la fecha de la emasculación. En la misma planta o una vecina, es conveniente marcar una inflorescencia de igual desarrollo.

A los dos a cuatro días, de acuerdo con el clima, se procederá a observar las flores marcadas, examinando si sus estambres tienen polen maduro, en caso positivo se procede a realizar la fecundación. Se recolectarán estambres con polen maduro de las flores de las plantas padre de la capsula de vidrio. Después de verificar en la planta madre el aislamiento, se procede a sacar la bolsa. Los estambres recolectados son depositados, por el corte de la quilla en las flores madre. Nuevamente se recubre la inflorescencia con la bolsa, en caso de clima muy seco, es necesario incluir una hoja dentro de la bolsa aislante. Doblando la bolsa en su base, y cerrando con un clip, para mantener una humedad alta.

1.1  Fase IV F1 x M₃

Las semillas F1 del cruzamiento de M3 x L.exaltatus. se les siembra, se les da los cuidados del cultivo descrito en el Cuadro 4 y paralelamente se siembra las semillas M3 guardadas. Para seleccionar las plantas se sigue el criterio descrito en la sección 6.3.2 y obtener polen para realizar el retrocruzamiento.

La selección de las plantas F1 se realizará en floración, se tomará en cuenta las características anteriormente dichos en la sección 6.3.2. Posteriormente se etiquetará con una cinta roja (no aceptadas) y azul (aceptabas) las plantas.

En floración las plantas seleccionadas con la cinta azul se realizan un Retrocruzamiento con el polen de (M3). Para la obtención de semilla (BC-1). El proceso para el retrocruzamiento será por emasculación y polinización descrito en el Cuadro 9.

1.2   Fase V BC-1 x M3 hasta el BC-7

Primera generación de (BC-1), se siembran y se hace análisis a las hojas de las plantas para desechar los individuos con alto contenido de alcaloides > 2 % (2 g/100g) en las hojas en la fase de floración. Paralelamente se siembran las semillas del M3 para la obtención del polen. Se seleccionan las plantas con las características dichas en la sección 6.3.2 en la fase de floración. Se realiza un retrocruzamiento a las plantas de BC-1.con el polen del M3. Se espera a la formación de las vainas. Se realiza la cosecha y se vuelve a repetir el mismo proceso hasta el BC-7.

1.3       Fase VI BC-7 x BC-7

Una vez obtenido las semillas BC-7, se les sembrará, se les dará los cuidados descritos en el Cuadro 4. En floración se seleccionarán las plantas con las características descritas en la sección 6.3.2. Posteriormente se etiquetará con una cinta roja (no aceptadas) y azul (aceptabas) las plantas.

Las plantas con etiqueta azul realizarán una autofecundación. Después formarán las vainas, cada planta será cosechada individualmente para realizar un análisis de contenido del alcaloide en las semillas (el proceso se explica en el Cuadro 7), se clasificará en 3 grupos Cuadro 10. Para guardar en el banco de Germoplasma para futuras mejoras.

Cuadro 10. Criterio para la clasificación de las plantas según el contenido de alcaloides en las semillas.

Grupo 1	Grupo 2	Grupo 3
<3.5 hasta 2.5 %	<2.5 hasta 1.95 %	<1.95 %

1.    REFERENCIAS:  

Abarca, L. (1988). Estudio de métodos de enmasculacion en el cultivo de chocho (Lupinus mutabilis Sweet). Escuela Superior de Chimborazo, Riobamba (Ecuador). Facultad de Ingeniería Agronómica. 122p. 

Caicedo, C., Murillo, A., Pinzón, J., Peralta, E., & Rivera, M. (1992). INIAP-450 Andino: Variedad de chocho (Lupinus mutabilis Sweet). Manejo agronomico y recetas para su consumo. INIAP.  

Delgado, D. (1970). Frecuencia de mutaciones en semillas de frijol utilizando radiaciones gamma. Organización de Estados Americanos. Departamento de Fitotecnia y suelos. Disponible en: http://repositorio.bibliotecaorton.catie.ac.cr/handle/11554/2189  

Gross, R., & Von Baer, E. (1977). Possibilities of Lupinus mutabolis and Lupinus albus in the Andean countries. Archivos latinoamericanos de nutricion, 27(4), 451-472.  

Hatzold, T., Elmadfa, I., & Gross, R. (1983). Edible oil and protein concentrate fromLupinus mutabilis. Plant Foods for Human Nutrition, 32(2), 125-132.   

Jacobsen E., Mujica A. (2006). El tarwi (Lupinus mutabilis Sweet.) y sus parientes silvestres. Botánica Económica de los Andes Centrales. Universidad Mayor de San Andrés, La Paz. 458-482pp.  

López, M. A. R., Macías, R. R., & Pérez, S. N. (2006). Evaluación químico-nutricional de Lupinus exaltatus Zucc, del nevado de colima, México, como fuente potencial de forraje. Interciencia, 31(10), 758-761.  

Márquez, C. (2016). La siembra de chocho es más rentable. Líderes (El Comercio). Obtenido de: https://www.revistalideres.ec/lideres/siembra-chocho-produccion-chimborazo.html  

Peralta, E., Murillo, A., & Mazón, N. (2015). Línea del tiempo. Mejoramiento genético de los granos andinos en Ecuador: Quinua, chocho, amaranto y ataco. INIAP.   

Villacres, E., Peralta, E., Cuadrado, L., Revelo, J., Abdo, S., & Aldáz, R. (2009). Propiedades y Aplicaciones de los Alcaloides del Chocho. INIAP Archivo Historico.    

Williams W., Harrison E., Jayasekera S. 1982. Genetical control of alkaloid production in lupinus mutabilis and the effect of a mutant allele mutal isolated following. Euphytica 33 (1984) 811-817.  

Yumbla, M. (2006). Estudio de factibilidad para la producción, industrialización y comercialización de chocho (Lupinus mutabilis Sweet), con enfoque de granja integral en el cantón Montúfar–Carchi. Quito: USFQ, 2006. 

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