Clones de café (Coffea arabica) tolerantes a sequia mediante la tecnología CRISP/Cas9.
David Apolo1, Andrés Amaya1, Alexis Lara1, Oscar Loya1
1 Universidad Central del Ecuador – Ingeniería
Agronómica – Genotecnia Vegetal.
RESUMEN Coffee (Coffea spp) is
one of the most important crops worldwide and is one of the main agricultural
activities carried out in Ecuador, due to its economic and social importance in
generating foreign exchange and employment. However, the regular export of
coffee from Ecuador has been affected by decisive events, such as drought.
There are more than 130 species of the genus Coffea, but only three are
commercially cultivated: Coffea arabica L. (2n = 4x = 44), Coffea canephora P.
(2n = 2x = 22) and Coffea liberica Bull. (2n = 2x = 22). Which present
limitations for their genetic improvement through conventional programs due to
their perennial nature and differences in the level of ploidy and
incompatibility. There are important characteristics such as resistance to
pests or resistance to drought, these are not present in the available
germplasm The objective of the present work was to obtain coffee (Coffea
arabica) clones that represent drought tolerances without compromising
performance, using CRISP / Cas technology. We show that genome editing by the
CRISPR / Cas9 method is an efficient and reliable way to use genes of agronomic
interest in the coffee tree, we also show that the use of somatic
embryogenesis, As a method of regenerating genome-edited plants, it could
restrict the choice of specific genes to those that are not essential for the
germination and development steps of new species.
1.
Introducción
2. Objetivos
2.1.
Objetivo general
·
Obtener clones de café (Coffea
arabica) que representen tolerancias a estrés abiótico sin
comprometer el rendimiento, mediante la tecnología CRISP/Cas.
2.2
Objetivos
específicos
·
Selección de genotipos que presenten
tolerancia a estrés hídrico, inducidos por el sistema CRSP/Cas.
·
Seleccionar mediante marcadores
moleculares 10 genotipos promisorios y obtener un clon con tolerancia a estrés
hídrico.
1.
HIPÓTESIS
· CRISP/CAS 9 es una tecnología adecuada para desarrollar híbridos mutagénicos de café que presenten tolerancia a estrés hídrico.
Planteamiento
de problema
La sequía es el factor abiótico que más limita la producción agrícola
del café, las principales zonas susceptibles productoras de café arábigo en el
Ecuador, están ubicada en las provincias de Manabí, Loja, El Oro, Guayas
representan más del 80% de la producción total. Productores de café, afirman
que la cosecha 2019-2020 presenta pérdidas de hasta el 50 por ciento debido a
plagas y la sequía que se prolongó durante el año pasado se estima que perdieron
el 25 por ciento de la cosecha debido a la sequía y falta de lluvia, otro 15%
debido a Roy y 10% por Broca. Una respuesta a esta
problemática es desarrollar nuevas variedades tolerantes a sequia usando la tecnología CRISPR / Cas9 acelerar ando enormemente la
investigación y el mejoramiento de nuevas variedades. Ya que se introducirá
genes de resistencia a sequia de café
arabico a otras variedades de la zona en específico para obtener una mejor
resistencia de las plantas de una zona especificada mejorando la calidad de las
plantas para las zonas cafetaleras del ecuador, Acortando el tiempo requerido
para la reproducción de estas nuevas variedades.
3. Evidencia
Tabla N°1.- Tabla de evidencias
de la problemática de sequía en café el Ecuador
|
Problema |
Factores abióticos |
Factores bióticos |
Mejoramiento |
Perdidas |
|
Disminución
en la producción de café |
La falta
de lluvias afecta gravemente la producción de café, pues el intenso calor
está quemando las plantas y perjudica la floración, aunado a la resequedad
del suelo. Esto implica que las expectativas para esta cosecha no sean
buenas, |
La
roya es una de las enfermedad ha afectado al cultivo de cafe |
El
método de mejoramiento de pedigrí se utiliza principalmente para la mejora
del café, es un proceso largo que implica + que requiere un mínimo de 30 años
para desarrollar un nuevo cultivar |
La
sequía ha empezado a perjudicar cierta cafetales de las zonas cafetaleras del
Ecuador como los Rios, Manabí, Loja,
Pichincha, |
|
Los
minadores de la hoja La defoliación afecta la
capacidad de la planta de realizar la fotosíntesis. El fruto podría no
madurar |
El
desarrollo del sistema CRISPR / Cas9 en el café aceleraría Enormemente
la investigación y el mejoramiento de nuevas variedades. Acortar el tiempo
requerido para la reproducción |
Productores
de café, afirman que la cosecha 2017-2018 presenta pérdidas de hasta el 50
por ciento El 25%
de la cosecha debido a la sequía y falta de lluvia, otro 15 debido Roya y 10
a causa de la aparición de la Broca
|
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Las
cochinillas son un grupo de insectos que se alimentan de varios árboles y
plantas. En el café. |
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|
|
Alrededor de
28.328,75 hectáreas cafetaleras son
afectadas.
|
4. Revisión bibliográfica
En la actualidad
muchas regiones cafetaleras se han visto afectadas por prolongados períodos de
sequía, debido a la disminución de las precipitaciones provocadas por la
variabilidad del cambio climático, y esto ha provocado importantes reducciones
en los rendimientos.
La escasez de agua que afecta a la provincia genera preocupación en el sector agropecuario, especialmente en los cantones del sur considerados “secos”, en el fenómeno El Niño de 1983, en los 4 primeros meses del año cayeron 1.885 milímetros por metro cuadrado. En el fenómeno El Niño de 1998 las precipitaciones sumaron 1.826,50 mm. El año 2017 se consideró que hubo un “evento extraordinario” influenciado por lo que los investigadores llamaron “El Niño Costero”: cayeron 1.709,70 mm.En año 2019, en el mismo período, las precipitaciones alcanzaron los 754,40 mm. Entonces, la preocupación tiene una base que obliga a un trabajo urgente coordinado desde el Ministerio de Agricultura y Ganadería (MAG).
Señaló que hasta el 22 de abril habían recibido 6.355 avisos de siniestro que corresponden a 20.328,75 hectáreas afectadas. Dorys Reyes, presidenta del GAD de la parroquia Membrillal, indicó que la situación en su zona es preocupante, ya que 600 hectáreas se han perdido. Esta zona y la de Julcuy, parroquia de Jipijapa, son secas y no cuentan con pozos profundos, peor con sistemas de riego, por lo que las pérdidas son cuantiosas.
La falta de lluvias en estos primeros meses del año afecta gravemente la producción de café, pues el intenso calor está quemando las plantas y perjudica la floración, aunado a la resequedad del suelo. Esto implica que las expectativas para esta cosecha no sean buenas.
La sequía ha empezado a resentir en los cafetales de las zonas cafetaleras del Ecuador como los Rios, Manabí, Loja, Pichincha, son altamente productores del aromático grano, y “algunas plantaciones comienzan a presentar afectaciones la floración como el proceso de producción para la próxima cosecha están en grave riesgo, pues la sequía que se presenta en la zona está quemando las plantas, sumando a la falta de humedad o lluvias.
Es un hecho ampliamente conocido la sensibilidad particular que cada
fase de desarrollo de un cultivo presenta a los factores ambientales.
Particularmente en el caso del estrés hídrico, la fase de floración parece ser
la más sensible en la mayor parte de los cultivos en que su producto final lo
constituyen granos o frutos; lo cual ha sido ampliamente, la mayor tasa de
evapotranspiración de los cultivos se produce en las fases de floración y
maduración, que son las etapas de desarrollo de mayor actividad fisiológica.
Todas las especies de café, a excepción de Coffea arabica L., Coffea
heterocalyx L. y Coffea anthonyi L.,
son autoincompatibles (Davis et al., 2006), y además C. arabica L. es la única especie no diploide (Mishra y Slater,
2012). La especie arabica es un alotetraploide autofértil (2n=4x=44), producto
de la hibridación espontánea entre Coffea canephora Pierre. (progenitor paterno)
y Coffea eugenoides L. (progenitor materno) (Lashermes et al., 1999), con un
tamaño de genoma de 1300 Mpb (Lashermes et al., 2008).
Las diferentes ploidías en el género Coffea obstaculizan la introducción
de características agronómicas de las especies diploides hacia las tetraploides
y por esto, es tan importante el uso de técnicas que puedan romper estas
barreras entre especies y que sirvan para complementar los programas
tradicionales de mejoramiento genético y, a la vez la base genética disponible.
El mejoramiento del café y la obtención de un nuevo cultivar con base en las
metodologías tradicionales, es un proceso que requiere alrededor de treinta
años (Melese, 2016) y esfuerzos, ya que comprende varios pasos como la
selección de las especies o variedades a utilizar, su consiguiente hibridación
y evaluación de la progenie resultante, en algunos casos retrocruces, y cruces
interespecíficos (Orozco y Schieder, 1982).
Una de las nuevas tecnologías con potencial uso en programas de
mejoramiento genético vegetal no convencional es la técnica de repeticiones
palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRIPSR-Cas9, por
sus siglas en inglés). Esta permite el corte de una molécula de ADN de manera
precisa y controlada, logrando modificar la secuencia del genoma al eliminar o
insertar nuevo ADN (Ran et al., 2013). Este mecanismo es utilizado por muchas
bacterias como un sistema inmune que las protege de ácidos nucleicos externos
de virus o plásmidos, en el cual se incorporan al genoma bacteriano secuencias
del ADN invasor (ADN espaciador) entre repeticiones de una secuencia corta. Los
transcritos de estos ADN espaciadores procesados como ARNcr se hibridan con un
segundo ARN conocido como ARNtracr (transactivador de CRISPR), formando un
complejo el cual se une a la enzima caspasa 9 (Cas9) y la guían hasta el ADN
blanco en la que esta realizan los cortes (Sander y Joung, 2014).
La edición del
genoma, que es un avance tecnológico sin precedentes, ha proporcionado un medio
valioso para crear mutaciones específicas en los genomas de las plantas. En
este estudio, desarrollamos una herramienta web genómica para identificar todas
las secuencias diana de gRNA en el genoma del café, junto con posibles dianas o
ff. En total, se identificaron 8.145.748 guías CRISPR en el borrador del genoma
de Coea canephora correspondientes a 5.338.568 secuencias diferentes y, de
estas, 4.655.458 eran únicas y 514.591 cubrían exones. La prueba de concepto se
estableció al apuntar al gen de la fitoeno desaturasa (CcPDS) utilizando la
técnica de transformación Agro-bacterium tumefaciens y la embriogénesis
somática como método de regeneración de la planta. Un análisis de los eventos
de edición del genoma guiados por ARN mostró que el 22,8% de las plantas
regeneradas eran mutantes heterocigotos y el 7,6% eran mutantes homocigotos. Se
estimó que la eficacia de la mutación en el sitio objetivo era del 30,4
5. Materiales y métodos
Para el uso de
esta herramienta de edición de genomas mediante CRISPR-Cas9 en el cultivo del
café, se necesita conocer exactamente los genes específicos para las
características que se quieren alterar, por lo que, se han buscado genes
candidatos para su posterior uso como genes blanco.
Los genes Dreb están involucrados en tolerancias de estrés abiótico como
la sequia estos genes candidatos para
tolerancia a sequía al comparar las respuestas moleculares a este factor en dos
cultivares comerciales de C. arabica L.: IAPAR59 (tolerante a la sequía) Y
Akawa (susceptible). Estas variedades crecieron en campo bajo condiciones
control con irrigación, y en condiciones de sequía, se analizaron
Material vegetal: Se utilizara 500 plántulas de Coffea arabica estas variedades
crecieron en campo bajo condiciones control con irrigación, las plantas
seleccionadas se obtendrán de un vivero de café ubicado la provincia de Loja, cantón Puyango,
parroquia Mercadillo.
a) Fase de laboratorio
Protocolo
de Agrobacterium: La fase de laboratorio
de establecerá en el laboratorio de biotecnología vegetal de la faculta de ciencias agrícolas,
Universidad Central del Ecuador.
Se produjeron en ex plantes de hojas jóvenes
(1 cm 2 piezas) después de 1 mes de cultivo en MS de concentración media
(Murashige y Skoog 1962 ) medio de calogénesis (Yasuda et al. 1985 ). Los
explantes que contenían callo primario se transfirieron a un medio de
producción de callo embriogénico MS de concentración media, en el que permanecieron durante 6 a 8 meses hasta la producción
de callo
embriogénico. Líneas transgénicas de C.
canephora clon 197 fueron generados por Agrobacterium- Transformación mediada
utilizando el EHA105 A. tumefaciens presion. Para el co-cultivo, los callos
embriogénicos se mantuvieron en frascos.
La suspensión bacteriana fue se retiraron y
los explantes inoculados se cultivaron conjuntamente a 20 ° C durante 5 días en
la oscuridad. Después de este período, los explantes se enjuagaron dos veces
con 20 mL de agua estéril, luego de lo cual se realizaron 20 mL de medio Yasuda
(Yasuda et al. 1985 ) que contiene 1,2 g L −1 de cefotaxima a cada frasco.
Los cultivos se colocaron en un agitador
rotatorio a 30 rpm durante 3 h (Etienne 2005 ). A continuación, se eliminó el
líquido y se enjuagaron los callos con medio Yasuda durante 15 min. Se eliminó
el líquido y los explantes se secaron sobre papel de filtro seco para eliminar
el exceso de solución bacteriana.
Posteriormente se colocaron durante un mes en
placas Petri de 100 mm de diámetro conteniendo 25 mL de medio Yasuda con 500 mg
L −1 de cefotaxima.
Los callos embriogénicos se subcultivaron mensualmente en el mismo
medio con 100 mg L −1 de higromicina y concentraciones decrecientes de
cefotaxima (250, 125, 50 m L −1) hasta la regeneración de embriones somáticos
en etapa cotiledonaria supuestamente transformados. Los embriones
cotiledonarios se transfirieron mensualmente al medio de maduración de
embriones de sales MS de concentración media (M) (Déchamp et al. 2015) hasta la
regeneración
b)Fase de campo: Una vez
obtenido la F1 se procederá a la siembra de estas plantas para después de 4
años se procederá seleccionar las mejores plantas, para luego llevar la
multiplicación de las plantas por medio de estacas
c)Fase de Evaluación: Cuando las
plántulas lleguen a 6 meses se midió la capacidad de campo del sustrato y se
definieron los tratamientos de déficit hídrico y el control con riego normal; a
las plantas con déficit hídrico se les suspendió el riego hasta un 30% de la
capacidad de campo, correspondiente a una humedad del suelo de 24%,
determinado, experimentalmente, y en el cual las plantas mostraron síntomas de
déficit hídrico, mientras que en las plántulas control se mantuvo la humedad
del suelo en 80%, de acuerdo con su capacidad de campo, que corresponde a una
humedad del suelo de 48%. Para mantener la humedad del suelo.
Variables evaluadas: Durante 10 meses, se presentan los resultados para las variables altura, área foliar, resistencia estomática, número de hojas, longitud de la raíz primaria y secundaria, peso seco de la raíz, peso seco de la parte aérea, biomasa total.
Cuadro 1. Esquema de mejoramiento
6. Cronograma
|
Tiempo (meses) |
Progenies |
Etapa
del esquema |
Número
de plantas |
|
1-2
|
1 a 2 progenitores |
obtención de semilla asexual |
5000 plantas in vitro |
|
2-3 |
5000 |
F1 A. Siembra de la semilla botánica o sexual |
5000 |
|
3-36 |
5000 |
B. Evaluación de plantas |
Parcela de 50 plantas
|
|
36-58 |
30 a 60 por parcela |
D. Selección |
5000 |
|
59-60 |
5000 a 10 clones |
E. Siembra |
Similar a la etapa anterior en varias
localidades y durante 2 años |
7. Conclusiones
La Ingeniería Genética ha permitido ampliar el campo
del mejoramiento vegetal a partir del manejo y la transferencia de genes de
interés, aplicándose especialmente en plantas de importancia agronómica y
comercial, como el café. Esta planta ha sido la base de estudios y pruebas que
incluyen el cultivo in vitro y la transformación genética con métodos
físicos y biológicos, logrando la expresión de genes y la modificación de la
expresión de genes endógenos en este caso genes resistentes a sequía y permitan
crear nuevas variedades que se adapten a las necesidades de los agricultores.
8.
Referencias
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