LECTURA 3A

 Estrategias para el desarrollo de marcadores genéticos eficientes en la selección de caracteres agronómicos

Baquero Vallejo Gioconda Mishell¹, Dennis Bladimir Valencia Mafla ²

Abstract Chapter III of the thesis explains the strategies that serve to develop efficient markers that facilitate character selection in any genetic improvement program. Therefore, an attempt is made to provide knowledge to facilitate the selection of characters. On the one hand, the validation of the QTLs detected in the Vf6 x Vf27 population was carried out by Cruz Izquierdo (2009) and Cruz-Izquierdo et al. (2012) by evaluating the RIL population in two new campaigns. Secondly, a first approach was made to the conservation study of these QTLs in different genetic funds. For this, four crosses were selected, involving five of the six starting parents. In all cases, the female parent chosen was the Vf 937 genotype, which would facilitate the comparability of the results. Within the same objective, the comparison of results was also carried out with the QTLs for agronomic characters of V. faba, identified by Ávila et al. (2005) by aligning the involved genetic maps. Finally, the synteny ratios and the information available in M. truncatula were used to identify candidate genes responsible for characters related to plant height and height of the first flowering node and the first pod node.

1       Introducción

Esta tesis analizó los programas de mejora de habas y se determinó que estos programas son sumamente complejos y demandan una gran cantidad de recursos materiales y económicos (Rodríguez, 2017).

Por ende, como nos indica Rodríguez, (2017) es necesario el desarrollo de una estrategia de selección asistida por marcadores resulta interesante al permitir una selección precoz e independiente del ambiente que disminuye el coste de las evaluaciones de campo, sobre todo en las fases iniciales de selección. En este caso la aplicación de marcadores moleculares en habas permitió avanzar en la investigación sobre las bases genéticas de caracteres de interés para la especie. Así, el desarrollo de mapas genéticos que ha hecho posible, la identificación de QTLs de resistencia a las principales enfermedades que afectan al cultivo: jopo, ascoquitosis y mancha chocolate.

La aplicación de estrategias como el BSA (Bulk Segregant Analysis) permitió la identificación de marcadores ligados a la resistencia a roya (Avila, 2005), así mismo se aseguró caracteres de calidad del grano como la ausencia de taninos y el bajo contenido en vicina-convicina. Todos estos fueron los primeros pasos hacia el desarrollo de marcadores eficientes para la selección y por lo tanto útiles (Torres, 2010).

Olmos, (2004) también presenta otra estrategia es la selección asistida por marcadores o también llamada MAS, para esta estrategia se necesitó la validación de los resultados obtenidos en pruebas y selecciones anteriores. En el caso de los caracteres cuantitativos es necesaria una detección lo más precisa posible de las regiones asociadas a cada carácter. Para esto es necesaria una validación de los QTLs obtenidos, primero en distintos ambientes, lo que permite el estudio de la interacción Genotipo x Ambiente y de la estabilidad de los QTLs en las distintas condiciones (Rodríguez, 2017).

La disponibilidad de marcadores comunes permite el fácil el alineamiento de distintos mapas de ligamiento y la comparación de los resultados obtenidos en experimentos distintos como el estudio de las correspondientes poblaciones F2 y F2:3 para diferentes caracteres de interés, aportan una información preliminar importante respecto a la base genética de los mismos y también se puede emplear para evaluar la posible estabilidad de los QTLs (Valverde, 2007).

Según Rodríguez, (2017). En las poblaciones desarrolladas y el estudio de la asociación entre su segregación y el fenotipo de cada familia se tiene una idea de la posible conservación de estos QTLs en los distintos fondos genéticos y por lo tanto de la utilidad de los marcadores que se identifiquen o desarrollen en el programa de mejora.

Otra de las ventajas que presentan los marcadores es que permiten comparar el mapa de habas desarrollado con el mapa de otras especies de leguminosas como la lenteja (Lens culinaris L.). Con esta posibilidad se abrió la puerta a la transferencia de información desde otras leguminosas a las habas y viceversa (Cruz, 2012).

Desde la introducción de los marcadores RAPDs, estos se han utilizado de gran manera en los principales trabajos de mapeo de especies (Torres et al. 2010), poco a poco se han ido incorporando estos nuevos tipos marcadores con mayor potencial para la mejora (Ellwood, 2006).

En la actualidad se cuenta con distintos mapas de densidad más que aceptable basados en secuencias de genes (Webb, 2015)  Estos avances representan un salto cualitativo en el estudio de las bases moleculares de muchos procesos biológicos de interés para la mejora genética, Rodriguez, (2017) nos afirma que desde el punto de vista de la mejora nos van a permitir el establecimiento de estrategias de genes candidatos a través de las relaciones de sintonía que se entrelacen entre las distintas leguminosas y sobre todo con una especie modelo.

 

2       Materiales y Métodos

2.1      Identificación y validación de QTLs para arquitectura y rendimiento en la población Vf6×Vf27

2.1.1           Material vegetal

Se utilizó la población RIL derivada del cruzamiento Vf6 × Vf27 y compuesta por 124 líneas (Cruz, 2012). El parental femenino Vf6 es del tipo equina con color de testa beige y ha sido empleada en numerosos trabajos. El parental masculino Vf27, es del tipo paucijuga con color de testa oscuro y características primitivas, lo que aporta al cruzamiento un alto nivel de polimorfismo tanto morfológico como molecular.

2.1.2           Evaluación de caracteres

La experimentación consistió en un diseño en bloques al azar con 2 repeticiones. Cada familia o parental estuvo representado por un máximo de 10 plantas por repetición, sembradas en surcos de 1 metro separados 70 cm entre sí. Así mismo se empleó la variedad “Baraca” como control a razón de un testigo cada 21 surcos.

Los caracteres evaluados fueron agrupados en dos categorías:

·  Arquitectura de la planta: Altura del primer nudo con flor (HLF), altura del primer nudo con vaina (HLP), número de ramas (NTP), número de nudos con flor, flores por inflorescencia (FPI)

·  Caracteres del rendimiento: Número de óvulos por vaina, Número de semillas por vaina (NSP, Longitud de vaina (PL), Peso de 100 semillas (HSW), Número de vainas por planta (PPP).

Para cada familia RIL, la evaluación se realizó de forma individual en cada una de las plantas del surco, descartando las de los extremos, y se calculó el valor medio de las plantas evaluadas. Para el análisis de QTLs, a cada RIL se le asignó el valor medio de los valores obtenidos en cada una de las dos repeticiones de campo.

2.1.3           Análisis de QTLs

Todos los análisis se desarrollaron utilizando el programa Map QTL 5.0 Para cada uno de los caracteres se siguió el siguiente proceso: en primer lugar, se realizó el test no paramétrico de Kruskal-Wallis (KW) para detectar asociación entre los caracteres de interés y los marcadores individuales. Se desarrolló un análisis de Interval Mapping (IM). Teniendo en cuenta los resultados de los análisis KW e IM se seleccionó un conjunto inicial de cofactores y se determinó su significación con Map QTL 5.0. Se determinó el intervalo de confianza en la posición del QTL utilizando el método 2-LOD descrito por van Ooijen (1992). Todas las figuras relacionadas con mapeo de QTLs fueron obtenidas utilizando el programa Map Chart v2.2.

2.2     Validación en distintos fondos genéticos

2.2.1           Alineación con otros mapas publicados

Estudios recientes han desarrollado el mapa de la población RIL obtenida de esta población en la que se han incluido marcadores ESTs presentes en el mapa utilizado por Cruz-Izquierdo, (2012). Estos marcadores permitieron la comparación de los resultados obtenidos por Ávila et al. (2005) y Cruz-Izquierdo (2012) utilizando el mapa desarrollado por Gutiérrez et al. (2013) como puente. Para el alineamiento de los 3 mapas se utilizó el programa Map Chart v 2.2, que permite establecer las relaciones entre grupos de ligamiento de diferentes mapas en función de los marcadores comunes entre ellos.

2.2.2           Validación en los materiales en desarrollo

Para la validación de QTLs en distintos fondos genéticos se escogieron cuatro poblaciones F2 de entre los cruzamientos llevados a RIL. Estas cuatro poblaciones tienen en común el parental femenino Vf937, de tipo mayor.

2.2.3           Extracción de ADN y análisis de marcadores

La extracción de ADN se realizó utilizando hojas jóvenes recogidas en campo y siguiendo el protocolo de Lassner et al. (1989) con las modificaciones propuestas por Torres et al. (2010). Se incluyeron todos los individuos F2 de los 4 cruzamientos seleccionados junto con 5 parentales. La concentración de ADN de cada muestra se determinó con un espectrofotómetro.

Para el análisis con marcadores moleculares se seleccionaron 97 ESTs distribuidos a lo largo del mapa de la población RIL Vf6×Vf27. En primer lugar, se comprobó la amplificación de los marcadores en los parentales y en seis individuos de cada población F2. Se detectaron dos tipos de polimorfismo. El primero basado en diferencias de tamaño de las ampliaciones (marcadores ALP) y el segundo basado en diferencias de corte con enzimas de restricción (marcadores CAP). En todos los casos se utilizó 1 unidad de enzima de restricción, mientras que las mezclas de reacción y las condiciones de incubación fueron las recomendadas por el fabricante para cada enzima.

2.2.4           Asociación entre marcadores y caracteres

Para cada marcador, la relación entre los polimorfismos detectados y los caracteres estudiados se determinó mediante análisis de la varianza utilizando el programa Statistix v 9.1. En las poblaciones F2 se consideraron los siguientes caracteres, relacionados con la arquitectura de la planta: HLF, HLP, NTP y FPI y los caracteres relacionados con el rendimiento y sus componentes: NOP, NSP, PL, HSW y PPP. también se consideró el número de semillas por planta (NSP) y el rendimiento.

2.2.5          Estrategia de genes candidatos para el carácter “altura de planta” y relacionados.

Se obtuvo la correspondencia entre los ESTs flanqueantes de los QTLs para altura de planta, HLF y HLP localizados en el cromosoma III de habas con sus homólogos en la especie modelo. Dada la colinealidad observada entre los genomas de las dos especies, de forma paralela se comprobó la posible ubicación de los genes candidatos para altura de planta, con el fin de determinar el posible papel de estos genes en el control de los caracteres considerados en V. faba.

3       Resultados y Discusión

3.1         Evaluación fenotípica de la población RIL Vf6 x Vf27

Los caracteres estudiados presentaron una variación continua lo que justifica el análisis de QTL para el estudio de la base genética de los mismos. Los análisis de la varianza (ANOVA) se han realizado teniendo en cuenta 3 ó 4 campañas de campo dependiendo del carácter de los obtenidos en esta tesis. Las líneas Vf27 (paucijuga) y Vf6 (equina) son muy diferentes como corresponde a sus tipos botánicos, por lo que se esperaba un alto nivel de polimorfismo tanto a nivel fenotípico como molecular. De hecho, el factor genotipo mostró una alta significación en los ANOVA. La interacción Genotipo × Ambiente fue significativa en todos los caracteres estudiados, lo que pone de manifiesto la importancia de validar los QTLs obtenidos en un número suficiente de campañas para obtener información útil para el programa de mejora de la especie. Resultados similares fueron encontrados por Cruz, (2009), si bien, en su caso, esta interacción no fue significativa para NF y HSW.

3.2      Identificación y validación de QTLs para arquitectura y rendimiento en la población Vf6×Vf27

Para los resultados del análisis de QTLs en las dos campañas estudiadas, la presencia de un QTL se ha considerado atendiendo al límite establecido mediante permutaciones. Sin embargo, en algunos casos se aceptaron QTLs cuyo LOD máximo fue inferior al nivel crítico propuesto.

3.3      Caracteres relacionados con la arquitectura de la planta

3.3.1           Altura del primer nudo con flor (HLF)

Se detectaron dos QTLs significativos para este carácter, uno en cada campaña evaluada, situados respectivamente en los cromosomas. La detección de varios máximos de LOD, en una misma región y en varias campañas indica la estabilidad de HLF-1, por lo que este QTL puede ser un buen candidato para su uso en los programas de mejora para este carácter.

3.3.2           Altura del primer nudo con vaina (HLP)

En esta región también se identificaron un máximo relativo en la curva de LOD cercano al valor crítico de permutaciones (HLP-1). En conjunto, estos datos indican la existencia de un QTL para HLP en esta zona, en la que además también se han detectado consistentemente un QTL para HLF. El segundo QTL fue detectado en la siguiente campaña (HLP-2-2012) en el cromosoma I. La validación de HLP-1 y HLP-2 en distintas campañas indica que ambos QTLs presentan una buena estabilidad. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos para HLF y HLP, parece que la región asociada en el cromosoma III puede ser bastante importante en el control genético de ambos caracteres.

3.3.3           Flores por inflorescencia (FPI)

El análisis de QTLs permitió la identificación de 3 QTLs para este carácter. El primero de ellos fue detectado en los dos años en estudio (FPI-1-2011; FPI-1-2012). Del mismo modo, los análisis de QTLs de las dos campañas permitieron determinar la estabilidad del QTL FPI-2, que fue localizado de forma consistente en ambas campañas Los resultados obtenidos para FPI-1 y FPI-2 son relevantes, ya que se ha comprobado la estabilidad de ambos QTLs en campañas distintas, lo que los convierte en idóneos para la identificación de genes candidatos responsables del carácter.

3.3.4           Número de nudos con flor (NF)

La falta de estabilidad en todos los casos indica que estos QTL no son buenos candidatos para el desarrollo de estrategias MAS en el programa de mejora de leguminosas, porque la verificación de QTL es un requisito previo esencial.

3.3.5           Número de ramas (NTP)

No se encontró ninguna QTL importante relacionada con este personaje. Ambos QTL mostraron aditivo negativo y explicaron el porcentaje similar de variación fenotípica de caracteres. De hecho, sus resultados pueden identificar 4 QTL, 2 en cada actividad evaluada, pero ninguno de ellos fue verificado. Además, el QTL determinado en 2007 es positivamente aditivo, mientras que el QTL 2008 es negativamente aditivo.

3.4      Caracteres relacionados con el rendimiento

3.4.1           Longitud de la vaina (PL)

En el estudio anterior de Cruz-Izquierdo, se describieron varios QTL relacionados con la longitud de la vaina, pero de las dos actividades de evaluación, solo dos QTL en los cromosomas II y V se mantuvieron estables. Este QTL explicó el 17% de la variación fenotípica y mostró una adición positiva. Sin embargo, PL-5-2012 se encuentra en el área donde se encuentra el QTL para caracteres relacionados (como HSW, NOP o NSP), que se discutirá en las secciones posteriores.

3.4.2           Número de óvulos por vaina (NOP)

Los datos no permiten la identificación de QTL que exceden el nivel de LOD establecido por permutación. Esta área es consistente con los resultados de Cruz-Izquierdo et al. Por lo tanto, nuestros resultados muestran que es el mismo QTL y se mejora su estabilidad. NOP-1-2012 * explicó el 10.7% de la variación fenotípica y, al igual que la actividad previa, exhibió aditividad negativa. En cualquier caso, como se puede ver en el histograma correspondiente, esta cruz tiene pocos cambios para el personaje.

3.4.3           Número de semillas por vaina (NSP)

Se identificó un único QTL en la misma región del cromosoma VI donde se ubica NOP-1-2012. De ahí que este QTL sea un buen candidato para la obtención de marcadores útiles para la selección. NOP y NSP sugiere de nuevo la posibilidad de que haya genes distintos, situados físicamente cerca, responsables de la base genética de los dos caracteres o bien, la existencia de un único gen con efecto pleiotrópico sobre ambos.

 

3.4.4           Peso en gramos de 100 semillas (HSW)

Se detectaron dos QTLs significativos para HSW. En ambos casos los valores de aditividad fueron positivos y explicaron porcentajes similares de la variación observada. Este QTL también mostró aditividad positiva y explicó el 13,5% de la variación fenotípica, pero su interés es menor al no haber sido validado en diferentes campañas.

3.4.5           Número de vainas por planta (PPP)

Se detectaron dos QTLs significativos para HSW. En ambos casos los valores de aditividad fueron positivos y explicaron porcentajes similares de la variación observada. Este QTL también mostró aditividad positiva y explicó el 13,5% de la variación fenotípica, pero su interés es menor al no haber sido validado en diferentes campañas.

3.4.6           Alineación con otros mapas publicados

Sin embargo, la ausencia de marcadores moleculares comunes en los distintos mapas de ligamiento ha dificultado el estudio comparativo de los resultados obtenidos hasta el momento en habas. Sin embargo, la comparación de sus resultados con los obtenidos en sucesivos trabajos ha resultado imposible dada la inexistencia de marcadores comunes entre los mismos. El número de marcadores comunes era muy limitado por lo que no se pudieron establecer muchas más relaciones. En este mapa se han incluido, además de marcadores RAPD y microsatélites comunes con la F2, marcadores ESTs comunes con mapas de otras poblaciones RIL de habas, entre ellas, la Vf6 Vf27. De hecho, se ha identificado HLF-3-2012, cercano a Prx-1 y también al marcador MCo048 que en la población 29H Vf136 ligó a marcadores RAPDs que, a su vez, están en el intervalo de confianza del Hlf-1 de la F.

3.5         Validación en el material desarrollado

3.5.1           Altura del primer nudo con flores (HLF) y del primer nudo con vainas (HLP)

Los resultados obtenidos en la población RIL Vf6 Vf27 demostraban la idoneidad de una región del cromosoma III, asociada a ambos caracteres, para estudiar posibles candidatos en la zona y para el desarrollo de marcadores moleculares para la selección en los programas de mejora de habas. Los 4 marcadores asociados a HLF en este cromosoma se encuentran situados en torno a los intervalos de confianza de los QTLs identificados en el cruzamiento Vf6Vf27. En el cromosoma V también se detectaron asociaciones significativas de marcadores cercanos al intervalo de confianza de uno de los QTLs para HLF.

3.5.2           Flores por inflorescencia (FPI)

Quizás por los buenos resultados obtenidos en el apartado anterior para FPI, en cuanto a estabilidad de QTLs en distintas campañas, esperábamos poder validar las mismas regiones del cromosoma I en distintos fondos genéticos. Sin embargo, los resultados no confirman los obtenidos tras el análisis de QTLs. No ocurre lo mismo para el QTL detectado en el LG06 ya que de los 4 marcadores seleccionados en el entorno de los intervalos de confianza calculados, tres fueron polimórficos y se genotiparon en distintas poblaciones. Desafortunadamente, esta zona está poco representada en el estudio porque hay pocos marcadores polimórficos en las 4 poblaciones.

3.5.3           Número de ramas (NTP)

Se habían detectado 4 QTLs para este carácter en la población Vf6 Vf27, pero sólo uno, situado en el cromosoma III, había sido validado en dos campañas, lo que indica que este carácter es muy dependiente del ambiente. Sin embargo, en esta última región hay muchos más marcadores polimórficos que no presentaron asociación con el carácter por lo que la asociación de MCo001 al número de ramas no se ha considerado para la validación de la zona. Nuevamente el marcador MCo048 resultó asociado con el carácter en estudio. En este caso, no se había detectado ninguna región asociada al carácter en el cromosoma V.

3.5.4           Longitud de vaina (PL)

Al estudiar la asociación de marcadores polimórficos en estas poblaciones con PL, se detectaron marcadores ubicados en el entorno e incluso dentro de los intervalos de confianza de los 5 QTLs descritos hasta el momento. Por ejemplo, se detectaron asociación significativa de 3 marcadores en el entorno de PL-2 en el cromosoma V. En nuestro trabajo, pese al bajo número de marcadores polimórficos en esta zona se detectó asociación significativa de los dos más próximos a la región del QTL. En la población Vf937 Vf172, esta asociación fue para los dos marcadores y en las dos generaciones evaluadas. En el mismo sentido, los dos marcadores polimórficos en el cruzamiento Vf937 Vf751 y flanqueantes del QTL PL-5-2012 en el mapa Vf6 x Vf27 mostraron asociación con este carácter.

3.5.5           Número de óvulos por vaina (NOP) y número de granos por vaina (NSP)

Los resultados parecen confirmar la importancia de las regiones del cromosoma I y del cromosoma VI donde se localizaron QTLs para estos caracteres en la población Vf6 Vf27. De hecho, Cruz-Izquierdo identificó 2 QTLs para NSP en el grupo de ligamiento 4 asignado al cromosoma I, aunque sólo MCo034 mostró asociación con este carácter. Por otra parte, en el cromosoma VI se observó asociación del marcador M1U053 con NOP en la población Vf937 x Vf422, mientras que para NSP se vio asociación con los marcadores MCo060 y M1U223 en el cruzamiento Vf937 x Vf751. Cabe destacar una región del cromosoma IV, situada entre los 155,2 y los 166,1 cM, que parece estar relacionada con el control genético de ambos caracteres.

4       Conclusiones

Para poder evaluar el potencial de variedades primitivas en la mejora de habas con el fin de ampliar la base genética del cultivo, se han desarrollado poblaciones RILs derivadas de cruzamientos entre los cuatro tipos botánicos que describió Muratova y algunas formas intermedias. Las poblaciones RIL obtenidas son un material idóneo para la realización de mapas de ligamiento que sirvan para el estudio de la base genética de cada carácter, así como para el desarrollo de estrategias de selección asistida por marcadores. Entre otras cosas, nos ha permitido hacer ya una preselección de qué poblaciones pueden ser de mayor interés para cada carácter. El análisis de componentes principales indica que no existen bloques génicos que expliquen la arquitectura genética de las poblaciones.

Los grupos de ligamiento asignados hasta el momento al cromosoma I, y que habían sido denominados como IB en distintos trabajos del grupo, han podido ser asignados físicamente al cromosoma IV de V. Esta información ha permitido cerrar el cuadro de homologías entra los cromosomas de habas y los del resto de las leguminosas ya que este era el único cromosoma al que no se habían asignado grupos de ligamiento hasta el momento.

Se han validado QTLs relacionados con los caracteres de arquitectura y rendimiento de habas en distintas condiciones ambientales a través de la evaluación y análisis de la población RIL Vf6 x Vf27 durante dos campañas adicionales a las dos ya estudiadas en trabajos previos de nuestro grupo. Como en trabajos precedentes, se ha corroborado la acumulación de QTLs en regiones concretas del mapa. En primer lugar, la existencia de marcadores comunes en distintos trabajos de mapeo y de análisis de QTLs para caracteres agronómicos en Vicia faba, ha permitido la comparación de resultados y con ella la validación de parte de los mismos. En segundo lugar, a través del genotipado y fenotipado de cuatro de las poblaciones F2 utilizadas en el trabajo también se han obtenido indicios sobre regiones conservadas en distintas poblaciones de la especie e incluso sobre nuevas regiones que podrían estar asociadas a algunos de los caracteres. En V. faba esta región ya había sido asociada al carácter de floración en un trabajo previo, pero, además, en el nuestro parece estar asociada a gran parte de los caracteres evaluados. Todo lo expuesto refuerza el interés de la zona para futuros estudios.

Mediante genómica comparativa también se ha llegado a la designación de genes candidatos para el QTL de altura de la planta identificado en el cromosoma III de V. faba.

5       Referencias

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