Estrategias para el
desarrollo de marcadores genéticos eficientes en la selección de caracteres
agronómicos
Baquero Vallejo Gioconda Mishell1, Dennis
Bladimir Valencia Mafla 2
Abstract
Chapter III of the thesis explains the strategies
that serve to develop efficient markers that facilitate character selection in
any genetic improvement program. Therefore, an attempt is made to provide
knowledge to facilitate the selection of characters. On the one hand, the
validation of the QTLs detected in the Vf6 x Vf27 population was carried out by
Cruz Izquierdo (2009) and Cruz-Izquierdo et al. (2012) by evaluating the RIL
population in two new campaigns. Secondly, a first approach was made to the conservation
study of these QTLs in different genetic funds. For this, four crosses were
selected, involving five of the six starting parents. In all cases, the female
parent chosen was the Vf 937 genotype, which would facilitate the comparability
of the results. Within the same objective, the comparison of results was also
carried out with the QTLs for agronomic characters of V. faba, identified by
Ávila et al. (2005) by aligning the involved genetic maps. Finally, the synteny
ratios and the information available in M. truncatula were used to identify
candidate genes responsible for characters related to plant height and height
of the first flowering node and the first pod node.
1 Introducción
Esta tesis analizó los programas de mejora
de habas y se determinó que estos programas son sumamente complejos y demandan
una gran cantidad de recursos materiales y económicos (Rodríguez, 2017).
Por ende, como nos indica Rodríguez,
(2017) es necesario el desarrollo de una estrategia de selección asistida por marcadores
resulta interesante al permitir una selección precoz e independiente del
ambiente que disminuye el coste de las evaluaciones de campo, sobre todo en las
fases iniciales de selección. En este caso la aplicación de marcadores
moleculares en habas permitió avanzar en la investigación sobre las bases
genéticas de caracteres de interés para la especie. Así, el desarrollo de mapas
genéticos que ha hecho posible, la identificación de QTLs de resistencia a las
principales enfermedades que afectan al cultivo: jopo, ascoquitosis y mancha
chocolate.
La aplicación de estrategias como el BSA
(Bulk Segregant Analysis) permitió la identificación de marcadores ligados a la
resistencia a roya (Avila, 2005), así mismo se aseguró caracteres de calidad
del grano como la ausencia de taninos y el bajo contenido en vicina-convicina.
Todos estos fueron los primeros pasos hacia el desarrollo de marcadores
eficientes para la selección y por lo tanto útiles (Torres, 2010).
Olmos, (2004) también presenta otra estrategia
es la selección asistida por marcadores o también llamada MAS, para esta
estrategia se necesitó la validación de los resultados obtenidos en pruebas y
selecciones anteriores. En el caso de los caracteres cuantitativos es necesaria
una detección lo más precisa posible de las regiones asociadas a cada carácter.
Para esto es necesaria una validación de los QTLs obtenidos, primero en
distintos ambientes, lo que permite el estudio de la interacción Genotipo x
Ambiente y de la estabilidad de los QTLs en las distintas condiciones
(Rodríguez, 2017).
La disponibilidad de marcadores comunes
permite el fácil el alineamiento de distintos mapas de ligamiento y la
comparación de los resultados obtenidos en experimentos distintos como el estudio
de las correspondientes poblaciones F2 y F2:3 para diferentes caracteres de
interés, aportan una información preliminar importante respecto a la base
genética de los mismos y también se puede emplear para evaluar la posible
estabilidad de los QTLs (Valverde, 2007).
Según Rodríguez, (2017). En las
poblaciones desarrolladas y el estudio de la asociación entre su segregación y
el fenotipo de cada familia se tiene una idea de la posible conservación de
estos QTLs en los distintos fondos genéticos y por lo tanto de la utilidad de
los marcadores que se identifiquen o desarrollen en el programa de mejora.
Otra de las ventajas que presentan los
marcadores es que permiten comparar el mapa de habas desarrollado con el mapa
de otras especies de leguminosas como la lenteja (Lens culinaris L.). Con esta
posibilidad se abrió la puerta a la transferencia de información desde otras
leguminosas a las habas y viceversa (Cruz, 2012).
Desde la introducción de los marcadores
RAPDs, estos se han utilizado de gran manera en los principales trabajos de
mapeo de especies (Torres et al. 2010), poco a poco se han ido incorporando
estos nuevos tipos marcadores con mayor potencial para la mejora (Ellwood, 2006).
En la actualidad se cuenta con distintos
mapas de densidad más que aceptable basados en secuencias de genes (Webb, 2015)
Estos avances representan un salto
cualitativo en el estudio de las bases moleculares de muchos procesos
biológicos de interés para la mejora genética, Rodriguez, (2017) nos afirma que
desde el punto de vista de la mejora nos van a permitir el establecimiento de
estrategias de genes candidatos a través de las relaciones de sintonía que se
entrelacen entre las distintas leguminosas y sobre todo con una especie modelo.
2 Materiales y Métodos
2.1 Identificación y validación de QTLs para arquitectura y
rendimiento en la población Vf6×Vf27
2.1.1
Material vegetal
Se utilizó la
población RIL derivada del cruzamiento Vf6 × Vf27 y compuesta por 124 líneas
(Cruz, 2012). El parental femenino Vf6 es del tipo equina con color de testa
beige y ha sido empleada en numerosos trabajos. El parental masculino Vf27, es
del tipo paucijuga con color de testa oscuro y características primitivas, lo
que aporta al cruzamiento un alto nivel de polimorfismo tanto morfológico como molecular.
2.1.2
Evaluación de
caracteres
La experimentación consistió en un diseño en bloques al azar con 2
repeticiones. Cada familia o parental estuvo representado por un máximo de 10
plantas por repetición, sembradas en surcos de 1 metro separados 70 cm entre
sí. Así mismo se empleó la variedad “Baraca” como control a razón de un testigo
cada 21 surcos.
Los caracteres evaluados fueron agrupados en dos
categorías:
· Arquitectura de la planta: Altura del primer
nudo con flor (HLF), altura del primer nudo con vaina (HLP), número de ramas
(NTP), número de nudos con flor, flores por inflorescencia (FPI)
· Caracteres del rendimiento: Número de óvulos
por vaina, Número de semillas por vaina (NSP, Longitud de vaina (PL), Peso de
100 semillas (HSW), Número de vainas por planta (PPP).
Para cada familia RIL,
la evaluación se realizó de forma individual en cada una de las plantas del
surco, descartando las de los extremos, y se calculó el valor medio de las
plantas evaluadas. Para el análisis de QTLs, a cada RIL se le asignó el valor
medio de los valores obtenidos en cada una de las dos repeticiones de campo.
2.1.3
Análisis de QTLs
Todos los análisis
se desarrollaron utilizando el programa Map QTL 5.0 Para cada uno de los
caracteres se siguió el siguiente proceso: en primer lugar, se realizó el test
no paramétrico de Kruskal-Wallis (KW) para detectar asociación entre los
caracteres de interés y los marcadores individuales. Se desarrolló un análisis
de Interval Mapping (IM). Teniendo en cuenta los resultados de los análisis KW
e IM se seleccionó un conjunto inicial de cofactores y se determinó su
significación con Map QTL 5.0. Se determinó el intervalo de confianza en la
posición del QTL utilizando el método 2-LOD descrito por van Ooijen (1992).
Todas las figuras relacionadas con mapeo de QTLs fueron obtenidas utilizando el
programa Map Chart v2.2.
2.2
Validación en distintos
fondos genéticos
2.2.1
Alineación con otros
mapas publicados
Estudios recientes
han desarrollado el mapa de la población RIL obtenida de esta población en la
que se han incluido marcadores ESTs presentes en el mapa utilizado por
Cruz-Izquierdo, (2012). Estos marcadores permitieron la comparación de los
resultados obtenidos por Ávila et al. (2005) y Cruz-Izquierdo (2012) utilizando
el mapa desarrollado por Gutiérrez et al. (2013) como puente. Para el
alineamiento de los 3 mapas se utilizó el programa Map Chart v 2.2, que permite
establecer las relaciones entre grupos de ligamiento de diferentes mapas en
función de los marcadores comunes entre ellos.
2.2.2
Validación en los
materiales en desarrollo
Para la validación
de QTLs en distintos fondos genéticos se escogieron cuatro poblaciones F2 de
entre los cruzamientos llevados a RIL. Estas cuatro poblaciones tienen en común
el parental femenino Vf937, de tipo mayor.
2.2.3
Extracción de ADN y
análisis de marcadores
La extracción de ADN se realizó utilizando hojas jóvenes recogidas en
campo y siguiendo el protocolo de Lassner et al. (1989) con las modificaciones
propuestas por Torres et al. (2010). Se incluyeron todos los individuos F2 de
los 4 cruzamientos seleccionados junto con 5 parentales. La concentración de
ADN de cada muestra se determinó con un espectrofotómetro.
Para el análisis con marcadores moleculares se
seleccionaron 97 ESTs distribuidos a lo largo del mapa de la población RIL
Vf6×Vf27. En
primer lugar, se comprobó la amplificación de los marcadores en los parentales
y en seis individuos de cada población F2. Se detectaron dos tipos de
polimorfismo. El primero basado en diferencias de tamaño de las ampliaciones
(marcadores ALP) y
el segundo basado en diferencias de corte con enzimas de restricción
(marcadores CAP). En todos los casos se utilizó 1 unidad de enzima de
restricción, mientras que las mezclas de reacción y las condiciones de
incubación fueron las recomendadas por el fabricante para cada enzima.
2.2.4
Asociación entre
marcadores y caracteres
Para cada marcador, la relación entre los polimorfismos
detectados y los caracteres estudiados se determinó mediante análisis de la
varianza utilizando el programa Statistix v 9.1. En las poblaciones F2 se
consideraron los siguientes caracteres, relacionados con la arquitectura de la
planta: HLF, HLP, NTP y FPI y los caracteres relacionados con el rendimiento y
sus componentes: NOP, NSP, PL, HSW y PPP. también se consideró el número de semillas
por planta (NSP) y el rendimiento.
2.2.5
Estrategia de genes
candidatos para el carácter “altura de planta” y relacionados.
Se obtuvo la
correspondencia entre los ESTs flanqueantes de los QTLs para altura de planta,
HLF y HLP localizados en el cromosoma III de habas con sus homólogos en la
especie modelo. Dada la colinealidad observada entre los genomas de las dos
especies, de forma paralela se comprobó la posible ubicación de los genes
candidatos para altura de planta, con el fin de determinar el posible papel de
estos genes en el control de los caracteres considerados en V. faba.
3 Resultados y Discusión
3.1
Evaluación
fenotípica de la población RIL Vf6 x Vf27
Los caracteres estudiados presentaron una variación continua lo que
justifica el análisis de QTL para el estudio de la base genética de los mismos.
Los análisis de la varianza (ANOVA) se han realizado teniendo en cuenta 3 ó 4 campañas
de campo dependiendo del carácter de los obtenidos en esta tesis. Las líneas
Vf27 (paucijuga) y Vf6 (equina) son muy diferentes como corresponde a sus tipos
botánicos, por lo que se esperaba un alto nivel de polimorfismo tanto a nivel
fenotípico como molecular. De hecho, el factor genotipo mostró una alta
significación en los ANOVA. La interacción Genotipo × Ambiente fue
significativa en todos los caracteres estudiados, lo que pone de manifiesto la
importancia de validar los QTLs obtenidos en un número suficiente de campañas
para obtener información útil para el programa de mejora de la especie.
Resultados similares fueron encontrados por Cruz, (2009), si bien, en su caso,
esta interacción no fue significativa para NF y HSW.
3.2 Identificación y validación de QTLs para arquitectura y
rendimiento en la población Vf6×Vf27
Para los resultados del análisis de QTLs en las dos campañas estudiadas,
la presencia de un QTL se ha considerado atendiendo al límite establecido
mediante permutaciones. Sin embargo, en algunos casos se aceptaron QTLs cuyo
LOD máximo fue inferior al nivel crítico propuesto.
3.3 Caracteres relacionados con la arquitectura de la planta
3.3.1
Altura del primer
nudo con flor (HLF)
Se detectaron dos QTLs significativos para este carácter, uno en cada
campaña evaluada, situados respectivamente en los cromosomas. La detección de
varios máximos de LOD, en una misma región y en varias campañas indica la
estabilidad de HLF-1, por lo que este QTL puede ser un buen candidato para su
uso en los programas de mejora para este carácter.
3.3.2
Altura del primer nudo con vaina (HLP)
En esta región también se identificaron un máximo relativo en la curva
de LOD cercano al valor crítico de permutaciones (HLP-1). En conjunto, estos
datos indican la existencia de un QTL para HLP en esta zona, en la que además
también se han detectado consistentemente un QTL para HLF. El segundo QTL fue
detectado en la siguiente campaña (HLP-2-2012) en el cromosoma I. La validación
de HLP-1 y HLP-2 en distintas campañas indica que ambos QTLs presentan una
buena estabilidad. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos para HLF y HLP,
parece que la región asociada en el cromosoma III puede ser bastante importante
en el control genético de ambos caracteres.
3.3.3
Flores por inflorescencia (FPI)
El análisis de QTLs permitió la identificación de 3 QTLs para este
carácter. El primero de ellos fue detectado en los dos años en estudio
(FPI-1-2011; FPI-1-2012). Del mismo modo, los análisis de QTLs de las dos
campañas permitieron determinar la estabilidad del QTL FPI-2, que fue
localizado de forma consistente en ambas campañas Los resultados obtenidos para
FPI-1 y FPI-2 son relevantes, ya que se ha comprobado la estabilidad de ambos
QTLs en campañas distintas, lo que los convierte en idóneos para la
identificación de genes candidatos responsables del carácter.
3.3.4
Número de nudos con flor (NF)
La falta de estabilidad en todos los casos indica que estos
QTL no son buenos candidatos para el desarrollo de estrategias MAS en el
programa de mejora de leguminosas, porque la verificación de QTL es un
requisito previo esencial.
3.3.5
Número de ramas (NTP)
No se encontró ninguna QTL importante relacionada con este
personaje. Ambos QTL mostraron aditivo negativo y explicaron el porcentaje
similar de variación fenotípica de caracteres. De hecho, sus resultados pueden
identificar 4 QTL, 2 en cada actividad evaluada, pero ninguno de ellos fue
verificado. Además, el QTL determinado en 2007 es positivamente aditivo,
mientras que el QTL 2008 es negativamente aditivo.
3.4 Caracteres relacionados con el rendimiento
3.4.1
Longitud de la vaina (PL)
En el estudio anterior de Cruz-Izquierdo, se describieron
varios QTL relacionados con la longitud de la vaina, pero de las dos actividades
de evaluación, solo dos QTL en los cromosomas II y V se mantuvieron estables.
Este QTL explicó el 17% de la variación fenotípica y mostró una adición
positiva. Sin embargo, PL-5-2012 se encuentra en el área donde se encuentra el
QTL para caracteres relacionados (como HSW, NOP o NSP), que se discutirá en las
secciones posteriores.
3.4.2
Número de óvulos por vaina (NOP)
Los datos no permiten la
identificación de QTL que exceden el nivel de LOD establecido por permutación.
Esta área es consistente con los resultados de Cruz-Izquierdo et al. Por lo
tanto, nuestros resultados muestran que es el mismo QTL y se mejora su
estabilidad. NOP-1-2012 * explicó el 10.7% de la variación fenotípica y, al
igual que la actividad previa, exhibió aditividad negativa. En cualquier caso,
como se puede ver en el histograma correspondiente, esta cruz tiene pocos
cambios para el personaje.
3.4.3
Número de semillas
por vaina (NSP)
Se identificó un único QTL en la misma región del cromosoma
VI donde se ubica NOP-1-2012. De ahí que este QTL sea un buen candidato para la
obtención de marcadores útiles para la selección. NOP y NSP sugiere de nuevo la
posibilidad de que haya genes distintos, situados físicamente cerca,
responsables de la base genética de los dos caracteres o bien, la existencia de
un único gen con efecto pleiotrópico sobre ambos.
3.4.4
Peso en gramos de
100 semillas (HSW)
Se detectaron dos QTLs
significativos para HSW. En ambos casos los valores de aditividad fueron
positivos y explicaron porcentajes similares de la variación observada. Este
QTL también mostró aditividad positiva y explicó el 13,5% de la variación
fenotípica, pero su interés es menor al no haber sido validado en diferentes
campañas.
3.4.5
Número de vainas por
planta (PPP)
Se detectaron dos QTLs
significativos para HSW. En ambos casos los valores de aditividad fueron
positivos y explicaron porcentajes similares de la variación observada. Este
QTL también mostró aditividad positiva y explicó el 13,5% de la variación
fenotípica, pero su interés es menor al no haber sido validado en diferentes
campañas.
3.4.6
Alineación con otros
mapas publicados
Sin embargo, la ausencia
de marcadores moleculares comunes en los distintos mapas de ligamiento ha
dificultado el estudio comparativo de los resultados obtenidos hasta el momento
en habas. Sin embargo, la comparación de sus resultados con los obtenidos en sucesivos
trabajos ha resultado imposible dada la inexistencia de marcadores comunes
entre los mismos. El número de marcadores comunes era muy limitado por lo que
no se pudieron establecer muchas más relaciones. En este mapa se han incluido,
además de marcadores RAPD y microsatélites comunes con la F2, marcadores ESTs
comunes con mapas de otras poblaciones RIL de habas, entre ellas, la Vf6 Vf27. De
hecho, se ha identificado HLF-3-2012, cercano a Prx-1 y también al marcador
MCo048 que en la población 29H Vf136 ligó a marcadores RAPDs que, a su vez,
están en el intervalo de confianza del Hlf-1 de la F.
3.5
Validación en el material
desarrollado
3.5.1
Altura del primer
nudo con flores (HLF) y del primer nudo con vainas (HLP)
Los resultados obtenidos
en la población RIL Vf6 Vf27 demostraban la idoneidad de una región del
cromosoma III, asociada a ambos caracteres, para estudiar posibles candidatos
en la zona y para el desarrollo de marcadores moleculares para la selección en
los programas de mejora de habas. Los 4 marcadores asociados a HLF en este
cromosoma se encuentran situados en torno a los intervalos de confianza de los
QTLs identificados en el cruzamiento Vf6Vf27. En el cromosoma V también se
detectaron asociaciones significativas de marcadores cercanos al intervalo de
confianza de uno de los QTLs para HLF.
3.5.2
Flores por
inflorescencia (FPI)
Quizás por los buenos
resultados obtenidos en el apartado anterior para FPI, en cuanto a estabilidad
de QTLs en distintas campañas, esperábamos poder validar las mismas regiones
del cromosoma I en distintos fondos genéticos. Sin embargo, los resultados no
confirman los obtenidos tras el análisis de QTLs. No ocurre lo mismo para el QTL
detectado en el LG06 ya que de los 4 marcadores seleccionados en el entorno de
los intervalos de confianza calculados, tres fueron polimórficos y se
genotiparon en distintas poblaciones. Desafortunadamente, esta zona está poco
representada en el estudio porque hay pocos marcadores polimórficos en las 4
poblaciones.
3.5.3
Número de ramas
(NTP)
Se habían detectado 4
QTLs para este carácter en la población Vf6 Vf27, pero sólo uno, situado en el
cromosoma III, había sido validado en dos campañas, lo que indica que este
carácter es muy dependiente del ambiente. Sin embargo, en esta última región
hay muchos más marcadores polimórficos que no presentaron asociación con el
carácter por lo que la asociación de MCo001 al número de ramas no se ha
considerado para la validación de la zona. Nuevamente el marcador MCo048
resultó asociado con el carácter en estudio. En este caso, no se había
detectado ninguna región asociada al carácter en el cromosoma V.
3.5.4
Longitud de vaina
(PL)
Al estudiar la asociación
de marcadores polimórficos en estas poblaciones con PL, se detectaron
marcadores ubicados en el entorno e incluso dentro de los intervalos de
confianza de los 5 QTLs descritos hasta el momento. Por ejemplo, se detectaron
asociación significativa de 3 marcadores en el entorno de PL-2 en el cromosoma
V. En nuestro trabajo, pese al bajo número de marcadores polimórficos en esta
zona se detectó asociación significativa de los dos más próximos a la región
del QTL. En la población Vf937 Vf172, esta asociación fue para los dos
marcadores y en las dos generaciones evaluadas. En el mismo sentido, los dos
marcadores polimórficos en el cruzamiento Vf937 Vf751 y flanqueantes del QTL
PL-5-2012 en el mapa Vf6 x Vf27 mostraron asociación con este carácter.
3.5.5
Número de óvulos por
vaina (NOP) y número de granos por vaina (NSP)
Los resultados parecen
confirmar la importancia de las regiones del cromosoma I y del cromosoma VI
donde se localizaron QTLs para estos caracteres en la población Vf6 Vf27. De
hecho, Cruz-Izquierdo identificó 2 QTLs para NSP en el grupo de ligamiento 4
asignado al cromosoma I, aunque sólo MCo034 mostró asociación con este
carácter. Por otra parte, en el cromosoma VI se observó asociación del marcador
M1U053 con NOP en la población Vf937 x Vf422, mientras que para NSP se vio
asociación con los marcadores MCo060 y M1U223 en el cruzamiento Vf937 x Vf751.
Cabe destacar una región del cromosoma IV, situada entre los 155,2 y los 166,1
cM, que parece estar relacionada con el control genético de ambos caracteres.
4 Conclusiones
Para poder evaluar el
potencial de variedades primitivas en la mejora de habas con el fin de ampliar
la base genética del cultivo, se han desarrollado poblaciones RILs derivadas de
cruzamientos entre los cuatro tipos botánicos que describió Muratova y algunas
formas intermedias. Las poblaciones RIL obtenidas son un material idóneo para
la realización de mapas de ligamiento que sirvan para el estudio de la base
genética de cada carácter, así como para el desarrollo de estrategias de
selección asistida por marcadores. Entre otras cosas, nos ha permitido hacer ya
una preselección de qué poblaciones pueden ser de mayor interés para cada
carácter. El análisis de componentes principales indica que no existen bloques
génicos que expliquen la arquitectura genética de las poblaciones.
Los grupos de ligamiento
asignados hasta el momento al cromosoma I, y que habían sido denominados como
IB en distintos trabajos del grupo, han podido ser asignados físicamente al
cromosoma IV de V. Esta información ha permitido cerrar el cuadro de homologías
entra los cromosomas de habas y los del resto de las leguminosas ya que este
era el único cromosoma al que no se habían asignado grupos de ligamiento hasta
el momento.
Se han validado QTLs
relacionados con los caracteres de arquitectura y rendimiento de habas en
distintas condiciones ambientales a través de la evaluación y análisis de la
población RIL Vf6 x Vf27 durante dos campañas adicionales a las dos ya
estudiadas en trabajos previos de nuestro grupo. Como en trabajos precedentes,
se ha corroborado la acumulación de QTLs en regiones concretas del mapa. En
primer lugar, la existencia de marcadores comunes en distintos trabajos de
mapeo y de análisis de QTLs para caracteres agronómicos en Vicia faba, ha
permitido la comparación de resultados y con ella la validación de parte de los
mismos. En segundo lugar, a través del genotipado y fenotipado de cuatro de las
poblaciones F2 utilizadas en el trabajo también se han obtenido indicios sobre
regiones conservadas en distintas poblaciones de la especie e incluso sobre
nuevas regiones que podrían estar asociadas a algunos de los caracteres. En V.
faba esta región ya había sido asociada al carácter de floración en un trabajo
previo, pero, además, en el nuestro parece estar asociada a gran parte de los
caracteres evaluados. Todo lo expuesto refuerza el interés de la zona para
futuros estudios.
Mediante genómica
comparativa también se ha llegado a la designación de genes candidatos para el
QTL de altura de la planta identificado en el cromosoma III de V. faba.
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