Hibridación somática en pitahaya para el control de Alternaria sp.

Guallichico Collaguazo Jonathan Stalin, Cóndor Quinchiguango Isaac Aaron, Maigua Rosero Angela Gabriela, Landeta Gómez Sebastian Alexander

Abstract

El control de enfermedades es una problemática constante en el manejo productivo de cualquier cultivo, y para el caso de la Pitahaya no es la excepción. En su desarrollo se pueden presentar todo tipo de enfermedades, una de las más comunes y con mayor afectación es la denominada “sarna” causada por el hongo Alternaria sp. En tal caso es necesario buscar un nuevo hibrido que tenga la capacidad de mejorar su resistencia a esta enfermedad. Para el caso se decide utilizar la técnica de hibridación somática, para la cual se propone iniciar con la fusión de protoplastos de dos progenitores que cumplen con características fenotípicas y genotípicas de interés. Hylocereus monoclanthus será considerada como el progenitor femenino y la especie Selenicereus megalanthus como el progenitor masculino. El resultante de esta fusión será un hibrido que mantenga y mejore su rendimiento anual, y con la capacidad de mejorar su tolerancia y resistencia al hongo descrito. De esta manera la obtención de este hibrido sería una ayuda para los agricultores y sus aspiraciones.

Palabras clave: Alternaria, híbridos, pitahaya, protoplastos.

1.      Introducción

La enfermedad comúnmente conocida como “sarna” en pitahaya, que afecta principalmente a los tallos es causada por el hongo Alternaria sp. Se presenta inicialmente con manchas café rojizo a lo largo de la planta en desarrollo y que posteriormente se convierte en sarnas (protuberancias en la epidermis del tejido). En los tallos produce un bloqueo del desarrollo de las estructuras de crecimiento (areolas y aristas). En condiciones de bajo nivel de manejo, la enfermedad puede causar hasta en el 80% de daño sobre el cultivo de pitahaya (Vargas et al., 2020).

La pitahaya es considera como la fruta tropical más rentable para exportación en la actualidad por sus cualidades morfológicas y nutricionales. Asia, Estados Unidos y Europa son los principales consumidores de esta exótica fruta, con 42 %, 50,6 % y 4,1

% de importaciones, respectivamente. Para 2019 las exportaciones nacionales de pitahaya superaron los $ 35,3 millones de dólares, con tendencia positiva (Lucero, 2020). Ecuador dispone aproximadamente de 1 528 hectáreas en producción de pitahaya, con un rendimiento promedio de 7.6 t/ha (Huachi et al., 2019).

El mejoramiento genético del cultivo de pitahaya en Ecuador no ha sido realizado, ya que es un cultivo relativamente nuevo. Sin embargo, hace algunos años se identificó la especie Cereus sp. (Cactaceae), la cual está registrada por el Banco Central del Ecuador, y es nativa del cantón Palora (Morona Santiago). Se determina que la especie corresponde a Stenocereus queretaroensis (Huachi et al., 2019). En otros países como México o Colombia se forman sitios de conservación ex situ, y proponen sistemas productivos de pitahaya en función de las necesidades de la especie utilizada. Esta

especificación en el manejo productivo se debe a la diversificación varietal de esta fruta, pues presentan dificultades en su establecimiento, baja tasa productiva y muerte de ejemplares (Manzanero-Acevedo et al., 2014).

2.      Objetivo general

Evaluar los híbridos somáticos obtenidos a través de la fusión de protoplastos en el cultivo de pitahaya.

2.1.  Objetivos específicos

·       Determinar la eficiencia de los híbridos somáticos de pitahaya a la resistencia de Alternaria sp.

·       Analizar la eficiencia de los híbridos somáticos de pitahaya en el rendimiento.

·       Comprobar la eficiencia del uso de fusión de protoplatos en el cultivo de pitahaya

 

3.      Planteamiento del problema

El continuo desarrollo y adaptación de patógenos a los controles sanitarios en la producción agrícola resultan un problema para el agricultor y sus aspiraciones de mantener en óptimas condiciones sus cultivos y cumplir con sus expectativas socioeconómicas. Esta problemática es independiente de la especie cultivada, pudiendo afectar principalmente a hortalizas y también a frutas. Por ende, es necesario buscar nuevas variedades mejoradas, con mayor resistencia a patógenos, y de pronta difusión entre agricultores. Además, esta búsqueda debe ser apoyada de las técnicas de mejoramiento genético que están en continuo avance y actualización en pro del desarrollo agrícola.

 

4.      Hipótesis

4.1.  Hipótesis alternativa

El híbrido resultante de la fusión de protoplastos entre los individuos Hylocereus monoclanthus y Selenicereus megalunthus contiene genes que lo hacen resistente a la enfermedad causada por Alternaria sp.

 

4.2.  Hipótesis nula

El híbrido resultante de la fusión de protoplastos entre los individuos Hylocereus monoclanthus y Selenicereus megalunthus no contiene genes que lo hacen resistente a la enfermedad causada por Alternaria sp.

 

5.      Marco Teórico

5.1.  Características generales de la pitahaya.

El centro de origen de la pitahaya está situado en México, siendo este fruto domesticado por estadounidenses precolombinos (Le Bellec & Vaillant, 2011). Las tribus Hylocereae, Pachycereae y Echinocereae generaron a las variedades nativas, silvestres y comerciales conocidas actualmente (Ruiz et al., 2015). En México existe un lugar conocido como Thianguistengo, en el cual, existen plantaciones de pitahaya coloniales desde el siglo XX, en el cual se destaca al género Stenocereus cuyo centro supone la mejora genética tradicional de las variedades actualmente domesticadas (Rosales-Bustamante et al., 2009).

Las cactáceas presentan características idénticas en sus cromosomas como: la uniformidad en los brazos y en la longitud, presentan tamaños cortos que oscilan entre 2 a 5 mm con presencia de constricciones. El género Hylocereus presenta un número cromosómico somático diploide de 2n:2x:22, pero con diferencias en el número de ploidía, que varía en género y especie (Grimaldo et al., 2001). Como el caso de H. megalanthus que es un tetraploide con 1n:4x:44 (Le Bellec & Vaillant, 2011). De igual forma, el género Selenicereus, conocido por la pitahaya amarilla, presenta un número cromosómico de 2n:4x:44 (Caetano, 2017).

 

La pitahaya amarilla (Selenicereus megalanthus) es una especie silvestre nativa de Ecuador (Morillo-Coronado et al., 2017). Es apetecida en el mercado extranjero y nacional por su sabor y forma exótica (Pastrana, 2011). La fruta presenta corteza de color amarillo con espinas fáciles de desprender, pulpa blanca con aroma y un gran número de semillas (Sotomayor et al., 2019). Una característica importante de esta variedad es su compatibilidad con el género Hylocereus debido a la hibridación intergenérica (Morillo-Coronado et al., 2017). Se elegio esta variedad por sus altos niveles de producción y se adapta mejor con el agricultor.

 

Por otro lado, la pitahaya roja (Hylocereus monoclanthus) es una especie cuyo género es originario de América Latina (Le Bellec & Vaillant, 2011). El fruto mide de 10 a 12 cm, presenta exocarpo rojo con brácteas verdes, su pulpa es brillante con semillas negras y presenta flores con forma de embudo con segmentos rojizos y amarillos (Verona et al., 2020). Es una planta diploide (Pastrana, 2011) y presenta potencial para resistir enfermedades fúngicas como Alternaria (Wu et al., 2021).

 

5.2.  Base genética

 

En la actualidad no está totalmente secuenciado todo el genoma de pitahaya. Sin embargo, Wu et al. (2021) describen que el genoma de H. undatus está estimado sobre la base de la evaluación de la distribución de K-mer hasta 1,58 GB. Para el caso de S. megalunthus Tel-Zur et al. (2011) describen que el contenido de ADN nuclear de esta especie es de 8,77 pg, y tiene además, un número de cromosomas base 2n = 44 (tetraploide).

 

Resulta ideal mantener al gen actina, cuyo Forward primer es 5'-3' (AAAGGCTAACAGGGAGAAAA), y su Reverse primer es 5'-3' (GACCACTGGCGTAAAGAGAA); pues es el gen más estable que se expresa en diferentes tejidos y etapas de desarrollo de la fruta. Ayudaría en futuros estudios de biología molecular y función génica en Hylocereus spp. y otras especies estrechamente relacionadas (Wu et al., 2021).

 

5.3.  Enfermedades

5.3.1.    Sarna del tallo y fruto

Causada por el agente fúngico Alternaria sp., se presenta en la planta con machas de tonalidades cafés rojizas que posteriormente se convierten en protuberancias en la epidermis del tejido. Afecta a los tallos provocando el bloqueo del desarrollo de las estructuras de crecimiento. En condiciones favorables puede causar hasta el 80% de daño en el cultivo.

 

5.4.  Rendimiento

La pitahaya es una fruta tropical con gran aceptación en el mercado por su sabor, apariencia y calidad. Ecuador dispone aproximadamente de 1528 ha de pitahaya con un rendimiento promedio de 7.6 ton/ha, en el Oriente ecuatoriano, específicamente en la provincia de Morona Santiago.

 

6.      Metodología

6.1.  Ubicación del experimento

La fusión de protoplastos se realizará en el laboratorio de Genotecnia vegetal, ubicado en el campo docente experimental CADET “La Tola”, de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador. Este sitio de estudio se encuentra ubicado a 2480 msnm.

6.2.  Material Vegetal

Los materiales vegetales utilizados para este estudio serán estacas de pitahaya de la especie H. monoclanthus considerada como el progenitor femenino y la especie S. megalanthus como el progenitor masculino, los mismo que se sembrarán en campo, para posteriormente realizar un cultivo de protoplastos para la obtención de híbridos. Las estacas seleccionadas suponen una presión de selección del 10%.

6.3.  Fusión de protoplastos

La fusión de protoplastos se basa en la utilización de células vegetales, en las cuales se degradó su pared celular con el uso de enzimas específicas. Posteriormente se escogerán estacas procedentes de los tallos de la pitahaya para ser usados en el experimento, además este material debe ser el más joven y no debe presentar daños mecánicos, ni daños por plagas.

6.3.1.        Desinfección del material vegetal

Se tomarán muestras de tallos jóvenes por las dos variedades de pitahaya, se dejarán en remojo durante seis horas en agua corriente. Luego se procederá a la desinfección con una solución de jabón líquido por 10 minutos (20 gotas x 1 litro), después una solución de benlate por 10 minutos (1 g x litro). Después se lavarán las muestras con agua estéril durante 15 minutos para finalmente realizar una desinfección con NaOCl al 2 % durante tres minutos.

6.3.2.        Obtención de protoplastos

Una vez aisladas las células vegetales se les eliminará la pared celular por medios enzimáticos. Se usa mezcla enzimática comercial principalmente compuesta por celulasas, hemicelulasas y pectinasas de diverso tipo. Estas enzimas se encargan de degradar los componentes de la pared celular, así como el tejido conector que une a las células entre sí, de forma que los protoplastos puedan quedar aislados en la suspensión.

6.3.3.       Limpieza y purificación de protoplastos

Se lleva a cabo un proceso de purificación para separar los protoplastos sanos, restos celulares, protoplastos rotos y células no digeridas entre otros

componentes. Se le somete a una serie de procesos de centrifugación, filtración y lavado que resulta, finalmente en una suspensión pura de protoplastos.

6.3.4.        Fusión química de protoplastos

El método de fusión química más utilizado actualmente consiste en la utilización de polietilenglicol (PEG), cationes de calcio (Ca²⁺) y pH elevado (entre 9 y 11). Durante este proceso las membranas plasmáticas de los protoplastos se ponen en contacto, formándose puentes citoplasmáticos entre ellas que son promovidos por el uso del PEG; por otro lado, el alto pH y la elevada concentración Ca²⁺ reduce la carga negativa neta que hay en la superficie de las membranas, disminuyendo la repulsión y facilitando este contacto inicial. Finalmente, las interconexiones citoplasmáticas entre las células se expanden dando lugar a una fusión de los protoplastos.

6.3.5.        Medios para cultivo de protoplastos fusionados

Los protoplastos que fueron fusionados se los colocara en medios sólidos de Murashige & Skoog, se selladaran con parafilm e incubadas a 25°C en obscuridad durante un mes y medio.

6.4.  Híbridos somáticos de pitahaya

Después de realizar todo el proceso de fusión de protoplastos se obtendrá plantas híbridas que contarán con resistencia a Alternaria sp., y tendrán grandes rendimientos. Estas plantas se las multiplicara mediante cultivo in vitro. Después serán llevadas a invernaderos para poder verificar su resistencia y rendimiento.

6.5.   Evaluación en campo

La implementación de las nuevas variedades se las colocará en tres localidades de la provincia de Morona Santiago con el fin de evaluar la resistencia a Alternaria sp. bajo diferentes condiciones agroclimáticas. La primera localidad es Morona, la segunda localidad es en Palora y la tercera localidad es en Taisha. Los sitios de evaluación se deben a que están ubicados en las principales zonas de producción del Ecuador.

6.5.1.        Severidad en Alternaria

La severidad se evaluará sobre una planta enferma, sobre el tallo afectado mediante la escala de Horsfall y Barrat, la cual se lleva de manera visual, con valores de 1 = libre de infección a mínimas manchas; 2 (1 a 5%), 3 (5 a 12%),

4 (12)a 20%), 5 (20 a35%), 6 (35 a 45%), 7 (45 a 60%), 8 (60 a 80%) y 9 (más

del 80%) del área foliar afectada con necrosis y clorosis generalizada.

6.5.2.        Progreso de la enfermedad

Una vez determinado las plantas más resistentes, comprendidas en las que presentan menor porcentaje de la enfermedad, se procederá a analizar el área bajo la curva, en la cual se evaluará el área foliar del tallo afectado en porcentaje sobre el tiempo expresado en días, determinando así la resistencia del cultivo.

7.      Producto

Para la obtención de híbridos somáticos mediante la fusión de protoplatos se utilizará dos progenitores Selenicereus megalanthus y Hylocereus monoclanthus. S. megalanthus nos proporcionara el gen de rendimiento y H. monoclanthus nos proporcionara el gen de resistencia a enfermedades fúngicas. Se utilizarán 200 explantes por cada progenitor, cada uno de estos serán desinfectados en un laboratorio. Los 200 explantes serán sometidas a medios enzimáticos que contendrán celulasas, hemicelulasas y pectinasas estas nos ayudarán a eliminar la pared celular de cada uno de los explantos. Después de este proceso obtendremos 100 protoplastos por cada especie de pitahaya. Se realizará una cruza de los 100 protoplastos de cada especie de pitahaya con la técnica de fusión de protoplasto, esta será de manera química. De todas estas cruzas se obtendrán 20 líneas homocigotas que serán llevadas para las respetivas evaluaciones en cultivo in vitro y después en invernadero. El resultado final serán aproximadamente 3 líneas que tengan la resistencia a Alternaria sp., y buenos rendimientos

8.      Resultados

Se espera obtener una variedad que presente las características genotípicas del progenitor A, tales como sus genes de resistencia contra la enfermedad fúngica conocida como Alternaria sp. y que presente las características fenotípicas del progenitor B, las cuales son el rendimiento, la coloración amarilla y la pulpa blanca, debido a que estas cualidades son más apetecidas por el consumidor. Adicional, que la variedad se mantenga su resistencia a lo largo del tiempo. De esta manera, se logra incrementar el rendimiento en el país, puesto que la pitahaya es una fruta catalogada como exótica y en los últimos años su demanda ha aumentado al igual que sus áreas de producción. Por otro lado, mejora los costos de producción de los agricultores debido a que no gastan en insumos químicos para su control y al no presentar la enfermedad su plantación genera más frutas con buena calidad para el mercado.

Esquema de mejoramiento en pitahaya

 

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