Mejoramiento genético del cultivo de fresa (Fragaria ananassa Duch.) a través del silenciamiento del gen FaPG1 para la obtención de una variedad con mayor vida en poscosecha

Calero María Paz¹, Galárraga Belén ¹, Galarza Alejandra ¹, Quenguan Ximena ¹

¹ Estudiantes de la Cátedra de Genotecnia Vegetal, Universidad Central del Ecuador (Grupo 2).

 

Resumen: La fresa es una planta de alta producción, cuyo fruto es de exquisito sabor y posee un alto valor nutricional muy apetecible en el mercado. La degradación de las pectinas de la pared celular mediada por poligalacturonasa juega un papel clave en el reblandecimiento de la fresa afectando su vida en poscosecha; con el silenciamiento de este gen se busca comprobar el detenimiento en el deterioro de la pared celular y demostrar si al silenciar el gen los efectos son efectivos. Es así que, la propuesta para la obtención de una nueva variedad a través del mejoramiento de edición genética es una herramienta viable que ayudará a los productores de este cultivo a aumentar sus ingresos económicos.

Palabras clave: poligalacturonasa, pectinas, silenciamiento de genes, vida útil.

 

Abstract: The strawberry is a high-production plant, whose fruit has an exquisite flavor and has a high nutritional value that is highly palatable in the market. The degradation of the pectins of the cell wall mediated by polygalacturonase plays a key role in the softening of the strawberry, affecting its postharvest life; With the silencing of this gene, the aim is to verify the arrest in the deterioration of the cell wall and to demonstrate if the effects are effective by silencing the gene. Thus, the proposal to obtain a new variety through genetic editing improvement is a viable tool that will help producers of this crop to increase their economic income.

Key words: polygalacturonase, pectins, gene silencing, shelf life.

 

I.       Introducción

La fresa es un fruto no climatérico, es decir que una vez cosechada esta no mejora su calidad gustativa, es altamente apreciada por sus excelentes propiedades organolépticas (Cote, 2011). Sin embargo, su conservación constituye un problema para los productores y la industria, ya que se caracteriza por poseer una elevada tasa respiratoria y como resultado obtenemos corta vida de almacenamiento (Mejía & Coello, 2010).

 

Durante la maduración de la fresa esta se debilita y sufre un reblandecimiento hasta llegar a adquirir una textura semilíquida al final del desarrollo. Esta pérdida de firmeza es consecuencia de los cambios en la composición de las paredes celulares, el etileno no estimula los procesos que ocurren durante la maduración de la fresa y las pectinas se rompen en esta fase provocando que se debilite la estructura de la pared. La eliminación del etileno de los almacenes puede reducir el desarrollo de enfermedades (Sandoval, 2018).

 

La vida útil postcosecha de la fresa destinada al consumo directo es muy breve, causando altos índices de pérdidas y desperdicios debido principalmente al proceso de ablandamiento que sufre su maduración. Esto limita su comercialización tanto por el deterioro en sí del fruto como por la mayor susceptibilidad al ataque de patógenos provocada por el ablandamiento. Dando lugar al uso excesivo de productos químicos para que la fruta tenga mayor tiempo de vida en percha

(Trejo-Márquez, Ramos-López, & Pérez-Guillén, 2007). 

 

En las enzimas pectato liasas se encuentran tres genes (pIA, pIB, pIC) que junto con las poligalacturonasas (FaPG1, FaPG2) expresan niveles altos durante el proceso de maduración de la fresa, debido a que su excesiva actividad enzimática provoca un ablandamiento notable, disminución de la textura e induce condiciones favorables para posibles ataques microbianos lo cual impide que el fruto tenga una vida larga en cuanto a la poscosecha (Nieto & Sánchez, 2011). En esta investigación se utilizará el gen FaPG1 con la finalidad de que exista una disminución del principal componente hemiceluloso, por lo tanto, este silenciamiento contrarrestará parte de los procesos de desmantelamiento de la pared celular de la fresa, obteniendo una dureza del fruto silenciado (Domenech, 2016).

 

II.    Problema de estudio

Los altos índices de pérdida de la fresa en el área de poscosecha sucede por el ablandamiento que ocurre en la pared celular y por ende las altas aplicaciones de químicos en esta fruta, esto afecta económicamente a los agricultores y campesinos en las actividades comerciales debido a que se llega a perder hasta un 30% de la cosecha que se realiza de tres a seis meses después de la siembra o también por la baja calidad del producto que se distribuye. Obtener una variedad con más vida útil en poscosecha reduce las pérdidas, mejora la economía del agricultor y reduce el uso de químicos.  

 

III. Objetivos

 

Objetivo General

·         Obtener una variedad de fresa con mayor tiempo de conservación en poscosecha, que ayude a reducir las pérdidas y desperdicios, enfocándonos en una producción agroecológica.

 

Objetivos específicos:

·         Identificar los genes que intervienen en el proceso de deterioro de la maduración de fresa en poscosecha para ser silenciados.

·         Conocer como la nueva variedad de fresa puede dar solución al alto índice de pérdidas y desperdicios que existen por motivos de calidad en poscosecha.

·         Aplicar el método más adecuado para el silenciamiento del gen que participa en el reblandecimiento de la fresa, durante la maduración.

·         Realizar un esquema de mejoramiento donde se obtenga una población con mayor vida útil en percha.

IV.  Hipótesis

Ha. Con el silenciamiento del gen FaPG1 la nueva variedad tendría efectos en la liberación de oligosacarinas de pectina que inducen la maduración de la fruta, logrando una mayor vida en poscosecha.

 

Ho. Con el silenciamiento del gen FaPG1 la nueva variedad no presenta efectos en la liberación de oligosacarinas de pectina que inducen la maduración de la fruta, logrando una mayor vida en poscosecha.

 

 

 

V.     Revisión de literatura

Según Brazanti (1989) la planta femenina de Fragaria chiloensis procedente de Chile fue seleccionada a partir del año 1712 por el tamaño de sus frutos, luego esta planta híbrida espontáneamente con una planta masculina de Fragaria virginiana que provenía del Norte de América, obteniendo a Fragaria x ananassa, especie que rápidamente se difundió en los continentes americano y europeo, cabe mencionar que en el viejo continente aparecen menciones sobre su consumo desde tiempos de la antigua Roma.

 

Este cultivo se extendió en Europa a finales del siglo XIX el momento en que empezaron a surgir los híbridos entre las especies europeas y las americanas, con frutos de mayor tamaño conocidos como fresones. Estos avances científicos en cuanto a mejoramiento genético y tecnológicos referentes a producción a lo largo del tiempo han contribuido para mejorar a la fruta y así convertirla en una de las más comerciales, ya sea como consumo en fresco o productos derivados (Coloma, 2011). Según PROEXANT (2002), afirma que la fresa en el Ecuador se cultiva en zonas desde 1200 hasta 2500 msnm y la temperatura óptima para el cultivo es de 15 a 20°C en el día y de 15 a 16 °C en la noche, la humedad relativa optima es de 60 a 75%.

 

La Fragaria X ananassa Duch se destaca por su contenido de vitamina C, taninos, flavonoides, antocianinas, catequina, quercetina, kaempferol y ácidos orgánicos tales como: cítrico, málico, oxálico. La producción económicamente rentable dura los dos primeros años, después de esta edad las plantas son más débiles, presentan bajos rendimientos y frutos de menor calidad. Por ser una planta híbrida, su propagación es vegetativa rápida y segura (Aaby, Mazur, Nes, & Skrede, 2012). Estudios han demostrado que algunos genes intervienen en el proceso de maduración del fruto, expresándose en varios tejidos, amentando su expresión durante la maduración y además su expresión está regulada en las hojas (Singh, Sharma, Kumar, Gupta, & Patil, 2008)

La vida útil postcosecha de la fresa destinada para el consumo en fresco es muy corta, debido a que el proceso de maduración ocurre rápidamente y las condiciones de calidad del fruto se mantienen por un corto tiempo (Skupień & Oszmiański, 2004). Esto limita la exportación a mercados distantes ya que conforme pasan los días la fruta es más susceptible al ataque de patógenos, provocado por el ablandamiento.    

A nivel mundial se producen 9.125.913 toneladas de fresa al año, siendo China el mayor productor con un volumen de 3.801.865 tn/año, EE. UU ocupa el segundo lugar con 1.420.570 tn; los dos países mencionados anteriormente generan el 57% del total mundial (FAOSTAT,2019). El Ecuador cuenta con un rendimiento de 1200 ha en el cultivo de fresa, la mayor producción se concentra en la provincia de Pichincha con 400 ha de cultivo, en segundo lugar, Tungurahua con 240 ha y otras provincias como: Chimborazo, Cotopaxi, Imbabura y Azuay con una producción de 40 hectáreas; con un rendimiento de 1.620 ton dentro de un área de cosecha de 105 hectáreas aproximadamente (FAOSTAT,2019).

 

Durante la maduración del fruto de la fresa las paredes celulares de las células parenquimáticas sufren varias modificaciones, una de ellas es la alteración de la estructura produciendo reblandecimiento. El reblandecimiento de la pared está mediado por la expresión de genes que codifican proteínas y enzimas que son capaces de modificar los polisacáridos de la pared celular. Las principales enzimas involucradas en los cambios de la textura del fruto es la poligalacturonasa (PG) y la pectato liasa (PL) jugando un papel muy importante en desmantelamiento de pared del fruto (Paniagua et al., 2015).

 

Una de las enzimas que participa durante la maduración de la fresa es la (PL) la cual degrada pectinas por acción de la β-eliminación, al contrario del mecanismo hidrolítico de las (PG). La expresión de los genes pIA, pIB y pIC  se encuentra limitada a fresas en estadio blanco y rojo maduro, se puede inhibir mediante tratamientos con auxinas (Domenech, 2016). Sin embargo, varios estudios afirman que la PL tiene un rol menor del procesamiento de la pectina en el ablandamiento de la fresa. El silenciamiento de FaPG1 por transformación antisentido reduce significativamente el ablandamiento del fruto de la fresa sin afectar otros rasgos relacionados con la maduración (Quesada et al., 2009).

 

En la célula existen varias formar de regular un gen y una es mediante el silenciamiento. Siendo un mecanismo celular donde se inhibe la expresión de genes. La regulación de la expresión de genes es un proceso vital para todas las formas de vida, muchos de los mecanismos regulatorios operan a nivel genético controlando principalmente el proceso de transcripción y traducción de los genes. Para silenciar un gen cualquiera de estos 2 procesos puede ser interrumpido. Cambiando la estructura del ADN en la localización de un gen específico, el código no puede ser transcrito a ARN mensajero. Para inhibir la traducción, la célula inactiva el ARN mensajero después de que el ADN se transcriba (Sánchez, 2017).

Los ARN reguladores son otras moléculas de ARN que tiene funciones como el nombre mismo lo dice de regular, como apagar los ARN mensajeros. Los microARN son un tipo de ARN regulador capas de ligar específicos ARN mensajeros con genes objetivos; los microARN bloquea el ARN mensajero logrando que el ribosoma no pueda acceder al código genético (Chávez, 2015).

 

VI.  Materiales y Métodos

 

Ubicación del experimento y condiciones ambientales

El experimento se llevará a cabo en la parroquia de San Isidro al sur del cantón Espejo en la Provincia del Carchi, con una ubicación 0°37’16’’N 77°56’24’’ O 0°37’16’’N 77°56’24’’O a una altura de 2980 msnm con una temperatura que oscila entre los 10 a 12°C, con una humedad relativa entre el 75 al 90%, con una precipitación anual que bordea los 115 mm/año. Los suelos se clasifican entre los inceptisoles, andisoles o suelos negros.

 

Material Vegetal

·         La fresa (Fragaria X ananassa var. Duch), es un híbrido, derivado de dos especies octoploides (2n=56) entre una fresa del norte de Estados Unidos (Fragaria virginiana Duch.) y una fresa sudamericana (Fragaria chiloensis (L) Duch) (Pérez, 2018).

·         La fresa (Fragaria x ananassa var. Albión) es una variedad de día neutro que tiene un tamaño intermedio de lento crecimiento inicial con temperaturas bajas en primavera, el fruto es firme y de color rojo externo de hombros más claros con bajas temperaturas y pulpa de color moderado, con una gran acumulación de azúcar (10-14° brix) (Mora & Ivars, 2019).

 

Para el material vegetal se va a utilizar un explante de tejido de hoja, mediante cultivo in vitro en un medio MS (Murashige y Skoog) se va a realizar la inducción del proceso de callogénesis en los explantes. La utilización de un método biotecnológico para mejoramiento genético hace posible la introducción de nuevas características que serían imposibles de obtener por vía del mejoramiento tradicional. Mediante este procedimiento se pueden incorporar o silenciar genes, a estos se les conoce como transgenes y su finalidad es otorgar a la planta de interés nuevas características agronómicas (Sanchez-Velázquez, 2014).

Los brotes se seleccionan en kanamicina y se mantienen en este medio de selección hasta la aclimatación, aproximadamente 20 a 30 semanas después de la inoculación de la hoja. Las plantas resistentes a la kanamicina se aclimataron, se transfirieren a invernadero (Valderrama, 2005).

 

Gen FaPG1

·         Poligalacturonasa (FaPG1)

La enzima poligalacturonasa (PG) cataliza la hidrólisis de las uniones del ácido galacturónico, actuando como endoenzima (rompe polímeros en diversas posiciones internas) o exoenzima (retira unidades de ácido galacturónico a partir del extremo no reductor de los poliurónidos).

El gen asociado a la pérdida de la firmeza en la pared celular es FaPG1, para poder inhibirlo se evalúa la expresión del gen mediante PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) en distintas etapas de desarrollo de la fresa y posteriormente colocar la secuencia genómica a la inversa con la finalidad de apagar el gen para que no se exprese (Quesada et al, 2009).

 

Construcción del plásmido

La región codificante de los genes FaPG1 se utilizarán para el diseño de un microRNA artificial. El microRNA seleccionado para silenciar dichos genes tiene como blanco una región conservada entre FaPG1 y FaPG2 (Chávez, 2015). Este micro-RNA se genera mediante PCR de sobrelape utilizando 4 oligonucleótidos, como molde para este PCR se utilizará el vector pRS300 que contiene el precursor del microRNA (Bermúedez, 2005). El promotor 35S se encuentra en las líneas APG (Martínez, 2015).

Los mi-RNA son ácidos nucleicos de aproximadamente 22 nucleótidos que regulan la traducción de mRNA codificantes (González, Matas, & Mercado, 2018). Los genes que codifican para estos RNA están localizados, comúnmente, en grupos policistrónicos dentro de los cromosomas (López, Salcedo, Ric-Varas, Matas, & Mercado, 2019).

 

Transformación de Fragaria x ananassa  mediante Agrobacterium tumefaciens

La Fragaria x ananassa Duch contiene un fragmento de ADN de 0.6 kb del gen FaPG1 (Mar, Morales, Rodríguez, & Reséndez, 2015) se duplico con Eco RI y se clonó en la orientación antisentido en el plásmido pRS300 flanqueado por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y la señal de poliadenilación (Mehana, 2007). El plásmido pRS300 se digirió previamente con Sma I y Kpn I para liberar el gen GUS. La presencia del gen FaPG1 insertado en orientación antisentido se confirmó mediante análisis de restricción (Moya, Mattus, & Herrera, 2019). El plásmido binario que contiene el fragmento FaPG1 antisentido se introdujo en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens mediante electroporación (Paniagua et al., 2015). Para la transformación de planta, se infectaron explantes de hojas de fresa var. duch en in vitro (Posé et al., 2013).

 

F1

Mediante el silenciamiento del gen anteriormente mencionado se obtendrán 200 plantas, en las cuales se va a apreciar las características fenológicas tales como: el tamaño, color y sabor del fruto, así como los contenidos en azucares o la acidez. ¾ no presentaran el gen inactivo, tienen interferencia en los genes y no se adaptan; por otro lado solo 1/4 poseen el gen inactivo PG controlando el reblandecimiento de las fresas.

 

 

F2

Se realizará un cruzamiento entre las plantas APG y parte de la población seleccionada de los ¾ de la F1. En los cuales verificaremos la manifestación del gen y poder seleccionar las plantas que no presentan interferencia de gen.

 

1 er Retrocruzamiento

Una vez que se obtenga la F2, el ¼ de plantas con el gene FaPG1 silenciados y que se adaptaron fácilmente; utilizaremos el fitomejoramiento mediante la retrocruza. Las plantas silenciadas son cruzadas con Fragaria x ananassa var. Albión; que donara características de buen tamaño, rústica, de hojas gruesas, fruto de color rojo fuerte, cónico, resistente al manipuleo. El resultado será ¾ de frutos pequeños, susceptibles a Phytophthora y Verticillium pero con alta productividad y precoces. Y ¼ de frutos con color rojo fuerte, con mayor vida en anaquel, tolerante a Xanthomonas sp.y resistentes al manipuleo.

 

2do Retrocruzamiento

Mediante un segundo retrocruzamiento entre la población ¼ de la primera retrocruza con Fragaria x ananassa var. Albión; se obtuvieron mejores resultados de las características deseables. ¼ de la población obtuvieron características de limitada resistencia al manipuleo, con un tamaño mediano del fruto y susceptible al ataque de Verticillium y Colletotrichum. Y un ¾ de la población la mayoría de las características deseables; que además exprese la característica deseable codificada por los genes silenciados.

Generaciones clonales

 

1er Generación Clonal Mediante la retrocruza se obtendrá 5000 genotipos que serán multiplicados bajo invernadero en camas de 1 metro de ancho por 13 de largo, a una distancia entre las hileras de 30 cm y la distancia sobre hilera de 30 cm, alternadas (zig-zag) para permitir mejor desarrollo de raíces y a nivel aéreo mayor ventilación. Las condiciones ambientales que se les dará a las plantas de fresa serán de dos tipos de riego; un riego normal y el otro un riego restringido. Al cabo de 4 meses se obtendrá ya plantas totalmente desarrolladas, donde; se clasificará mediante el número de frutos que produce cada planta y su precocidad.

 

2da Generación Clonal Las plantas que serán clasificadas de la 1era generación clonal se las llevara a campo abierto. Al igual que en la primera generación clonal se harán camas con las mismas medidas, se le aplicara los dos tipos de riego, el riego normal y el riego restringido. Las características por las que se seleccionarán las plantas de fresa serán por el tamaño del fruto donde se utiliza un calibrador, por la resistencia a Phytophthora y a Verticillium donde se inoculara la planta para ver si tiene resistencia. Se obtendrán 3000 genotipos con. 1 planta testigo.

3era Generación Clonal Las plantas que serán clasificadas de la 2da generación clonal tendrán las mismas condiciones ambientales que son; a campo abierto y con los dos tipos de riego, riego normal y restringido. En esta tercera generación las características a evaluar para clasificar las plantas serán con la precocidad de la planta, la adaptabilidad y además, el fruto será sometido a un manejo de postcosecha donde se contabilizará la vida útil, mediante un control cada 4 horas para ver su deterioro y mediante un penetrómetro se medirá el ablandamiento; se trabajará con tablas de color para clasificar solo plantas que tengas frutos de color rojo fuerte y además a los frutos se le medirá los azucares totales mediante un refractómetro para los °Bx. Se obtendrán solamente 1000 genotipos, con 1 planta testigo.

4ta Generación Clonal Las plantas que serán clasificadas de la 3era generación clonal tendrán las mismas condiciones ambientales que las dos últimas generaciones. En esta generación las plantas que se obtendrán tendrán todas las características deseadas que son: mayor vida poscosecha del fruto, precocidad de la planta, frutos grandes con color rojo fuerte y dulces, tendrá resistencia a Phytophthora y a Verticillium y estarán adaptadas a un riego normal y un riego restringido. Las líneas anti-PG obtenidas y seleccionadas, han mantenido el fenotipo estable a través de la propagación vegetativa durante varios años.

 

VII.                      Conclusiones

Se identificó la poligalacturonasa como el principal gen que afecta el reblandecimiento de la pared celular para, mediante los microARN ser silenciados y así evitar que el proceso de maduración de la fresa sufra un deterioro.

Se logró obtener una variedad de fresa que nos ayudara a solucionar el alto índice de pérdidas y desperdicios que existen en poscosecha por causa del reblandecimiento de los frutos durante la maduración.

Se logró realizar un esquema de mejoramiento genético capaz de guiar en la realización primero; de un silenciamiento de dos genes, para luego mediante dos retrocruzas obtener una variedad de fresa que tenga mayor vida útil en percha y con varias características agronómicas de interés; enfocándose en lo agroecológico.

 

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Anexos