Lectura 6B

 Variación de la forma del tubérculo y la profundidad del ojo en una familia diploide de papas andinas

Hannele Lindqvist-Kreuze ¹ *, Awais Khan ¹, Elisa Salas¹, Sathiyamoorthy Meiyalaghan², Susan Thomson², Rene Gomez¹ y Merideth Bonierbale¹

¹ Centro Internacional de la Papa (CIP), Av. La Molina 1895, Apartado 1558, Lima 12, Perú

² El Instituto de Investigación de Plantas y Alimentos de Nueva Zelanda, privado 4704, Christchurch 8140, Nueva Zelanda.

* Autor de Correspondencia: h.lindqvist-kreuze@cgiar.org

 

 

Resumen.  La apariencia de los tubérculos es muy variable en el germoplasma de papa cultivada en los Andes. Se evaluó la utilidad de descriptores morfológicos de la forma del tubérculo para la identificación de los loci genéticos responsables de la forma y la profundidad del ojo. Se utilizaron descriptores morfológicos subjetivos y medidas objetivas de longitud y ancho. De tres ensayos se utilizaron mapas genéticos basados ​​en la identificación del locus de rasgos cuantitativos (QTL). Siete formas morfológicas de tubérculos fueron identificados dentro de la población. Se encontró una distribución continua de fenotipos utilizando la relación entre la longitud del tubérculo y ancho del tubérculo. Las siete formas de tubérculos se clasificaron en dos grupos: cilíndrico y no cilíndrico. En el primer grupo, las formas clasificadas como 'comprimidas', 'redondas', 'oblongas' y 'alargadas'. Los tubérculos de este grupo tenían ojos más profundos, por lo que se encontró un QTL fuerte en la misma ubicación en el cromosoma 10 del mapa paterno. Los tubérculos no cilíndricos clasificados como 'obovoides', 'elípticos' y "alargados" estaban en el segundo grupo. Varios genes candidatos subyacentes a los marcadores QTL significativos para el tubérculo se identificaron la forma y la profundidad del ojo.

Palabras clave ·  Tubérculo · razas · cuantitativos · cromosoma · genes

 

1. Introducción

Hay una gran variabilidad en la apariencia de los tubérculos en germoplasma de papa cultivada. Mientras que las papas silvestres son generalmente pequeño y redondo con ojos bastante superficiales. Los tubérculos de variedades autóctonas de domesticación temprana son más grandes y tienen una gran variabilidad en la forma y la profundidad del ojo. Los agricultores andinos buscan mantener esta rica diversidad cultivando mezclas de variedades locales en sus campos. Así, las preferencias del usuario que aún persisten en la casa original de la domesticación de la papa son muy distintos de los asociados con la papa en las áreas que adoptaron este cultivo relativamente reciente. En variedades modernas, ojos superficiales, El color uniforme y la forma redonda u oblonga son preferenciales. Gran seleccionen consecuencia, ha llevado a una baja diversidad de estos rasgos en cultivares modernos.

Para revelar el control genético del tubérculo la forma y profundidad del ojo, se hizo varias categorías de clasificación, reflejando la variabilidad presente. Algunos estudios con Solanum tuberosum han utilizado categorías (redondo, largo),  (redondo, ovalado y de largo), o  (redondo, ovalado, ovalado largo, ovalado muy largo). En otros casos, como en una población híbrida entre S. verrucosum y S. microdontum,  se registraron 6 formas (largo, ovalado largo, ovalado, ovalado redondo, redondo, comprimido). En una población derivada de S. phureja  al inicio se puntuaron ocho tipos de formas, pero para el mapa genético se agruparon en tres clases principales (redonda, ovalada, largo). La profundidad del ojo se ha registrado previamente utilizando tres a nueve clases. El (CIP) cuenta actualmente con la mayor biodiversidad de patatas cultivadas. Los descriptores morfológicos para la forma del tubérculo utilizados por el banco de germoplasma del CIP incluyen ocho categorías básicas: comprimido, redondo, ovoide, ovoide, elíptica, oblonga, alargada y alargada, así como un conjunto adicional de nueve formas inusuales. Para la profundidad del ojo, la escala tiene cinco clases: protuberante, superficial, levemente profundo, profundo y muy profundo. La población de mapeo de retrocruzamiento diploide 'DMDD' fue desarrollado en el CIP y se utilizó para anclar la secuencia del genoma de la patata (DM) y desarrollar un mapa genético denso. La población, DM, pertenece a la S. tuberosum GrupoPhureja y el progenitor masculino recurrente, DI, de S.tuberosum diploide Andigenum Group Goniocalyx, proporcionando así algunas de las variaciones alélicas presentes en las Razas criollas andinas. DMDD segrega para numerosas morfológica, reproductiva, fisiológica, bioquímica y rasgos relacionados con el estrés abiótico, que combinado con el mapa genético de alta densidad y la referencia de alta calidad secuencia del genoma, abren grandes oportunidades para Trait-QTL y estudios de descubrimiento de genes. El presente trabajo se realizó para evaluar la utilidad de descriptores morfológicos para la forma del tubérculo identificación de los loci genéticos responsables de la forma y variación de la profundidad del ojo. Además, la generación de referencia se utilizó una secuencia de papa para buscar potenciales se han encontrado genes candidatos responsables del efecto QTL.

2. Métodos

2.1. Evaluación de material vegetal, campo e invernadero

Para la obtención de la población diploide DMDD, se realizó el cruzamiento entre DM1-356 R44 como progenitor femenino homocigótico y con el CIP703825 progenitor masculino diploide, posteriormente se realizó un retro cruzamiento con el hibrido CIP305156.17 (DMDI) como progenitor masculino. La población consta de 227 individuos, utilizando 187 para el mapa genético. Se cultivaron 3 ensayos en campo: La Molina, Lima, campo 1 con 134; San Agustín, Junín, campo 2 con 148 y Acos, Pasco, campo 3 con 117 individuos. En el caso de campo 1 inicio en julio hasta noviembre de 2011, los dos últimos desde septiembre hasta enero del siguiente año. En el cuadro … se detalla la información acerca de las localidades

Tabla 1.  Ubicación geográfica detallada de los ensayos de campo y las características de los datos de suelo y clima registrados en los sitios

 

Ensayo	Provincia	Localidad	Altitud msnm.	Latitud sur	Latitud oeste	Análisis de suelo			Temperatura					Humedad relativa%		Precipitación mm
						S-s-ca %	Omb %	Ph		Ec	Rango	Media		Rango	Media
Campo 1	Lima	La molina	244	−12.076289	−76.948417	57-25-15	1,3	7,4		4,3	12-25		16,0	70-91	85		<1
Campo 2	Junín	San Agustín	3265	−12.029167	−75.244167	39-31-30	1,6	0,4		0,4	1,6-30		12,5	12-100	78		332
Campo 3	Pasco	Acos	2612	−10.766444	−75.738361	66-16-18	1,9	0,7		0,7	2,9-24		13,5	14-91	72		290

 

Las plantas de campo 1 y 2 se cultivaron in vitro para después de 15 días ser llevadas a campo, con un diseño de enrejado alfa con 2 repeticiones, con 10 plantas en cada replica para campo 3 se sembraron tubérculos de segunda generación con el mismo diseño, tres replicas y 15 plantas por repetición.

La distancia en campo fue de 0,9 m entre hilera y de 0,3 m entre planta, se empleó riego por canales para campo1 y aspersores para campo 2 y 3. La fertilización se realizó al inicio de la siembra y con una segunda aplicación de nitrógeno durante el primer aporque. La cosecha se realizó cuando el 75 % llego a senescencia foliar.

2.2 Evaluación fenotípica y análisis estadístico

Para la selección fenotípica se lavaron y seleccionaron tubérculos desarrollados, cada uno fue clasificado mediante observación de acuerdo a los descriptores de Ortiz y Huaman, 1994,se determinaron 8 categorías basadas en la longitud y el ancho del tubérculo: comprimidos más largos que anchos; redondos y ovoides más largos que anchos con ápice más estrecho; obovoides más largos que anchos y tienen una base más estrecha; elípticos tienen un ápice y una base más estrechos que el medio; oblongos tienen un ancho similar en todas partes, dos veces más largos que anchos; alargados y oblongos tienen un ancho similar en todas las partes del tubérculo y su relación entre el largo y el ancho está entre dos y tres; y los tubérculos alargados son tres veces más largos que anchos.

Para forma de tubérculo también se midió la relación entre largo y ancho dividiendo estos dos. Para cada genotipo se utilizó el promedio de la relación largo y ancho de tres tubérculos. Para los que tenían una base o ápice más estrecho también se midió el ancho en la base y ápice. Se realizó un análisis básico y multivariado, se verificaron datos cuantitativos y cualitativos.

2.3 Construcción de mapas genéticos y análisis QTL

Mediante marcadores desarrollados por el Potato Genome Sequencing Consortium, para construir mapas genéticos y físicos para DMDD, estableciendo mapas para cada progenitor como lo descrito por Khan et al, 2014, se extrajeron los marcadores y los que tenían información incompleta, heterocigotos de ambos padres y segregaciones de dos alelos fueron excluidos. Los marcadores homocigotos del parental femenino y homocigotos del parental masculino se utilizaron para el mapa paterno.

Las posiciones del mapa y de los marcadores son presentados por Sharma et al., 2013. Para el mapeo se utilizó JoinMap 4 (Van Ooijen, 2006). Los datos fenotípicos y los mapas genéticos de los parentales se usaron para el análisis de QTL, empleando el mapeo de intervalos en MapQTL 6 (Van Ooijen, 2009). Para las variables categóricas se utilizó la prueba Kruskal-Wallis, los datos cuantitativos se realizaron mediante mapeo de intervalos. Se empleó una prueba de 1000 permutaciones para dar como significativo a un QTL. El marcador toPt-437059 con el valor LOD más alto se utilizó para validar la asociación rasgo-QTL. Los individuos de la progenie se agruparon según el genotipo del marcador (nn o np) para comparar los datos fenotípicos entre los dos grupos

2.4. Identificación in silico de genes candidatos

Loes genes se extrajeron de la pseudomolécula de DM AGPv4.3 dentro de la región cercana a los QTL significativos aproximadamente a 1cM, lo que corresponde a 1,31 Mb, 1,25 Mb y 2,17 Mb para los cromosomas 10, 12 y 5, respectivamente.

3. Resultados

3.1 Datos fenotípicos

Entre los genotipos parentales de DMDD, DM (CIP 801092) tenía tubérculos alargados con ojos superficiales, DI (CIP 703825) tenía tubérculos redondos y ojos profundos, y DMDI (CIP 305156.17) tenía tubérculos elípticos y ojos ligeramente profundos.

3.2 Características de los mapas genéticos parentales de DMDD

Ambos mapas parentales tenían 12 cromosomas correspondientes a los cromosomas de la papa. Para el mapa paterno se obtuvo con un promedio de 29 marcadores por cromosoma con un total de 339 marcadores mientras que para el materno se obtuvo un total de 423 marcadores con un promedio de 35 marcadores por cromosoma.

3.3 Forma del tubérculo y profundidad del ojo QTL

QTL para la relación entre la longitud del tubérculo y el ancho, la forma general y la profundidad del ojo se encontraron dentro de la misma región del cromosoma 10 en el mapa paterno. El marcador en el pico de este QTL es toPt-437059 y el alelo np del padre DI está asociado con las formas comprimidas, redondas, oblongas y alargadas. Estas clases de formas tienen en común una forma cilíndrica que tiene un ancho similar en toda la longitud del tubérculo.

Los tubérculos cilíndricos tienen ojos muy profundos con mayor frecuencia en comparación con los tubérculos no cilíndricos, pero ambos tienen ojos profundos. En el mapa materno, se encontró un QTL de pequeño efecto para la relación entre la longitud del tubérculo y el ancho y la forma general en la misma región del cromosoma 5, pero se detectó solo en el campo de prueba 2. También se encontró un QTL para la profundidad del ojo en el cromosoma 12 en el mapa materno.

3.4 Genes candidatos

Se escanearon en busca de genes candidatos en los cromosomas 5, 10 y 12 en los cuales había un total de 607, 375 y 133 genes dentro de las regiones que rodean el QTL en los cromosomas respectivamente. Las familias de genes más interesantes desde la perspectiva de la forma del tubérculo y la profundidad del ojo pertenecen a familias de genes asociados con la estructura y función celular, incluyendo homeobox, expansina, extensión y genes relacionados con la producción y modificación de pectinas. Los genes homeobox POTH1 y un gen similar a BEL-1 se encontraron a una distancia de 1,94 Mb y 1,37 Mb de los marcadores QTL pPt650026 en el cromosoma 5 y toPt-437059 en el cromosoma 10, respectivamente.

4. Discusión

Se encontraron marcador QTL toPt-437059, siete formas diferentes de tuberculos en la prgenie de DMDD pueden clasificarse en dos grupos: cilíndrico y no cilíndrico de acuerdo con los descriptores en la forma de tuberculos usados del banco de germoplasma de Centro Internacional de la Papa. Se identificaron los QTL con respecto a la relación entre el largo y ancho del tubérculo en el cromosoma 10 del mapa materno. Las formas comprimidas llevan el alelo marcador en el progenitor masculino recurrente, mientras que las formas alargadas forman el segundo grupo con el alelo del progenitor femenino. Los QTL se encuentran en la misma región genómica que los genes dominantes mapeados previamente para la forma el tubérculo redondo (Li X-Q, et al. 2005) y la forma QTL (Prashar A, et al. 2014). La forma Ro (forma tubérculo redondo) se encuentra en el cromosoma 10 que está controlado por múltiples alelos en S. tuberosum (van-Eck HJ, et al. 1994), siendo diploides andinos nativos como progenitores de DMDD S tuberosum phureja y S. tuberosum gonicalyx puede diferir S. tuberosum en la variación de la forma así mismo forma del ápice y la base.

Tabla 2. QTL significativo al 99% de umbral de significación de todo el genoma, identificado por la relación entre la longitud y ancho del tubérculo.

Mapa	Juicio	LOD	%	Intervalo 2- LOD cM	Cromosoma	Pico cM	Marcador de pico
Mapa paterno	Campo 3	13.21	40.5	28.95-39.308	10	32.545	toPt-437059
	Campo 2	15.07	37.8
Mapa materno	Campo 1	13.64	37.6	16.575- 40.6634	5	32.808	pPt-650026
	Campo 2	3.47	10.4

 

La variación en papas Nativas de los Andes hay en total 17 formas diferentes de tubérculos (Ortiz R, Huaman Z. 1994), se desconoce si toda esta variación puede explicarse por diferentes alelos en el Ro lugar, para registrar descriptores en la forma del tubérculo se necesita una población base más amplia y mapeo de asociación para probar esta hipótesis. En los QTL mayor en el cromosoma 10 explica la clasificación de la forma del tubérculo cilíndrico y no cilíndrico en DMDD, y en el QTL menor en el cromosoma 5 se origina en el progenitor femenino tiene un efecto sobre la forma del tubérculo.

La forma redonda está relacionada con ojos profundos en diploides S. tuberosum x S. phureja en segregación de poblaciones (Li X-Q, Prashar A, et al. 2005-2014) El manejo e intercambio efectivos de germoplasma se basa en descriptores morfológicos y moleculares estándar. Los descriptores morfológicos son un elemento esencial para la prueba de distinción, uniformidad y estabilidad (DHE) de nuevas variedades de papa. Las mediciones cualitativas incluyen el ancho del tubérculo en los externos de la rosa y el talón podrían usarse para mejorar la clasificación y capturar la variación en cruce biparental. En variedades locales se expresa un nivel mayor en la variabilidad para la forma del tubérculo, los descriptores según su importancia.

En los QTL para forma se encontraron varias familias de genes asociados con la estructura y función celular en los tubérculos de papa. Los genes de la superclase de genes homeobox  (Gehring WJ, Affolter M, Burglin T. 1994) de extensión de tres aminoácidos (TALE) en plantas (Bürglin TR. 1997), la asociación del BEL-1 es utilizado como un factor de transcripción StBEL5 y KNOX POTH1 muestran un desarrollo en los tubérculos (Banerjee AK, et al. 1997. Chen H, et al. 2009. Rosin FM, et al, 2003), además BEL-1 y POTH 1 están involucrado en la biosíntesis del ácido giberélico (Chen H, Banerjee AK, Hannapel DJ. 2004), ayuda como regulador de la tuberización en la papa (Roumeliotis E, et al. 2013). En los genes de la papa como BEL-1 y StBEL35 se encuentran en el cromosoma 10 (Sharma P, et al. 2014) las expansiones α- expansinas y  β- expansinas varias de las familias de genes de la superfamilia expansinas, como glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGP) abundan en las paredes celulares de las dicotiledóneas (Lamport DTA et al. 2011 y Showalter AM.1993), ayudan a la cicatrización de heridas en los tubérculos de papa (Neubauer JD, et al. 2012):

Varios estudios realizados en los genes relacionados con la pectina han demostrado que las proteínas AP2/ ERF desempeñan una función en la regulación de una variedad de procesos biológicos relacionados con el crecimiento y desarrollo de la planta (Licausi F, et al. 2010, Nakano T, et al. 2006 y Sharoni AM, et al. 2011). En resumen, el mapeo combinado de QTL y genómica comparativa, se han identificado un conjunto de genes candidatos potenciales que son responsables en la forma del tubérculo. Además, el mapeo fino o por asociaciones es necesarios para delimitar los candidatos para estudios funcionales adicionales y extracción de alelos para implicar los genes de la forma del tubérculo.

Tabla 3. Clasificación de los individuos de la progenie de DMDD según el marcador del genotipo Pt-437059, la forma del tubérculo y la profundidad del ojo en los tres ensayos de campo

ToPt-437059 genotipo/ensayo		Forma del tubérculo	Profundidad de los ojos
		Longitud media: relación de ancho (stdev)	Comprimido	Redondo	Obovoide	Elíptico	Oblongo	Alargado-Oblongo	Alargado	Superficial	Poco profundo	Profundo	Muy profundo
nn	Campo1	2,73 (0,77)	0	0	18	16	1	8	19	0	25	37	0
	Campo2	2,53 (0,78)	0	0	19	17	2	6	18	1	30	27	4
	Campo3	2,36 (0,52)	0	0	25	3	4	24	6	0	25	37	0
np	Campo1	1,6 (0,48)	0	5	1	2	20	13	0	2	2	23	14
	Campo2	1,5 (0,39)	1	0	1	0	23	16	0	0	3	24	14
	Campo3	1,43 (0,50)	8	2	1	0	18	11	1	0	10	30	1

Solo se incluyen los individuos de la progenie que se incluyeron en todos los experimentos (en total 103)

Referencias

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