Evaluación de
segregantes provenientes del híbrido simple de tomate de árbol (Solanum
unilobum x Solanum betaceum) para resistencia a (Colletotrichum acuatum).
R. P.
Espín-Anago1, E. P. González-Velozo1, F.B. Lino-Albán1,
G. M. Quiroga-Sánchez1, y C.
K. Simbaña Simbo1.
1Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias
Agrícolas, Quito, Ecuador.
Resumen. En los últimos
años se han desarrollado programas de mejoramiento realizados por el INIAP,
esto con el fin de desarrollar variedades que presenten resistencia a este
patógeno. Para esto se realizaron cruces de (Solanum betaceum x Solanum
unilobum), la primera con las características ideales para la
comercialización y la segunda por presentar resistencia al hongo. Esta progenie
tiene 50 % de su constitución genética como el progenitor recurrente. En su
forma general, el método consiste en llevar los procesos de retrocruzamiento en
cada progenitor donante (V1, V2 y V3) por separado, seleccionando hacia los
genes de resistencia de estos y hacia las características agronómicas del
progenitor recurrente ( L ). Cuando se considera que ha habido suficiente
recuperación, las líneas isogenicas L1 con genes de resistencia de V1; L2 con
genes de resistencia de V2 y L3 con genes de resistencia de V3 se mezclan
mecánicamente constituyéndose así la variedad multilineal (VML).
Palabras clave · Colletotrichum
· retrocruzamiento · progenitor · patógeno · isogénica ·
I.
INTRODUCCIÓN
El tomate de árbol
es uno de los productos de mayor importancia en el Ecuador, ubicándose en los
valles interandinos, y en algunas zonas de las provincias orientales, se estima
un rendimiento de 60 a 80 toneladas por hectárea (Feicán, Encalada &
Becerril, 2016). Por su sabor y características nutricionales podría
convertirse en un producto de exportación, sin embargo, esta planta es sensible
a varias plagas y enfermedades, lo cual dificulta su producción (Peñafiel, et al., 2009). Uno de los principales problemas son los
ocasionados por el hongo (Colletotrichum
spp.), causante de la antracnosis. Los daños que ocasiona disminuyen la
productividad desde un 60 hasta un 100 % (Pinto, Tiaguaro & Falconí, 2013).
Para
el control de este patógeno el control químico, ha sido empelado de manera
continua. Sin embargo el uso de fungicidas puede ser contraproducente, tanto
por su efecto toxico para el ambiente y por otorgarle resistencia al patógeno (Lobo, Medina, & Cardona, 2000).
Aunque existen varios métodos de control, estos no resultan completamente
eficaces, por lo que el desarrollo de una variedad resistente a este patógeno
se vuelve esencial.
Los
estudios realizados de caracterización morfológica y molecular han identificado a dos géneros causantes de
antracnosis en el país los cuales son C.
acutatum y C. gloeosporioides (Castro-Quezada et al., 2019). Se han desarrollado programas de
mejoramiento, por el INIAP donde realizaron cruces de (Solanum betaceum x Solanum unilobum), la primera con las
características ideales para la comercialización y la segunda por presentar resistencia.
Las generaciones resultantes presentaban mayor resistencia sin embargo perdían
calidad en el fruto, por lo cual se realizaron retrocruzamientos. (Viera et al., 2016). En posteriores estudios
se han evaluado las características de los segregantes de [(S. unilobum x S.
betaceum) x S. betaceum] x S. betaceum,
para reconocer los materiales promisorios. En los estudios realizados
por Perachimba Carlosama, (2018) se
evaluaron 105 plantas de los cuales los segregantes de los grupos GT7, GT10 Y
GT15 mostraron mayor resistencia, por lo
que han sido elegidos como materiales para el esquema de mejoramiento, mediante
el método multilineal, en la presente investigación.
II. OBJETIVOS.
Objetivo
general
Realizar un
esquema de mejora genética multilineal mediante retrocruzamiento entre (Solanum
betaceum X Solanum unilobum) para la obtención de una variedad
tolerante a antracnosis (Colletotrichum acuatum) y fijación de
características comerciales.
Objetivos
específicos
Determinar el
mejor método de fitomejoramiento para obtener resistencia a antracnosis (Colletotrichum
acuatum) en el cultivo de tomate de árbol.
Realizar
al menos 5 retrocruzas para fijar genes tanto de resistencia como de
características comerciales (96.87% genes del recurrente).
Obtener
al menos tres grupos de interés con materiales promisorios que contengan genes
de interés para desarrollo de resistencia vertical a antracnosis.
III.
HIPÓTESIS.
Hipótesis
nula: Utilizando
estos cruzamientos no se mejorará la variabilidad genética para resistencia a
antracnosis en la F1.
Hipótesis
alternativa:
Utilizando estos cruzamientos se mejorará la variabilidad genética para
resistencia a antracnosis en la F1.
IV. MARCO TEÓRICO
Generalidades
Es
un árbol pequeño de 2-6 m de altura con hojas cordadas y apiculadas con nervaduras
amarillentas en el haz. Su inflorescencia es cima con flores perfectas, pétalos
de color verde amarillento. El fruto es una baya, con tamaño que va desde los
4cm a 5cm de largo y 2cm a 3cm de ancho y con colores amarillo o naranja con
rayas longitudinales verde oscuro o púrpura. Semillas con forma lenticular de
color marrón claro con tamaño 3,5 a 4 mm de largo y 3 a 4 mm de ancho,
recubiertas con un mucilago de color naranja (Tamba, 2014).
Distribución del tomate
en el ecuador
El
tomate de árbol (Solanum betaceum) es
originaria de Sudamérica, en el Ecuador se encuentran en las provincias de
Imbabura, Pichincha y Tungurahua, consideradas como zonas de mayor producción,
están situadas a una altura de 1.200 a 3100 msnm (Ramírez, Grijalva, Navarrete,
& Guerrero, 2015). En total en el
país se cultivan 1478 hectáreas (Lucas Uquillas, Maggi Tenorio, & Yagual
Chang, 2010).
El primer caso reportado de antracnosis en tomate de
árbol se dio en el altiplano
ecuatoriano, donde los aislamientos provenientes de las provincias de Imbabura,
Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Bolívar, Loja y Azuay presentaban un 75% de C.acutatum
y el 25% proveniente de la provincia de Pichincha presentaron un grupo nuevo de
Collectotrichum no descrito
(Perachimba Carlosama, 2018).
Antracnosis
La
antracnosis en el tomate de árbol (Solanum
betaceum) es conocida como “ojo de pollo”, se produce por un hongo del
género Colletotrichum spp. Es la
principal enfermedad que causa máximas pérdidas (Fernández & Matute, 2010).
Según estudios realizados sobre las características moleculares que presenta Colletotrichum spp., mediante secuencias
ITS1-ITS4, se obtuvo como resultados que C.
acutatum es el causante de la antracnosis en tomate de árbol en el Ecuador
(Pinto, Tiaguaro, & Falconí, 2013).
Infección del patógeno
La
infección empieza cuando el inóculo llega al hospedero por el viento y
favorecido por la humedad relativa, generalmente las esporas se adhieren a la
superficie vegetal y germinan en un período de 12 a 24 horas, se genera el tubo
germinal, el cual crece una corta distancia antes de formar el apresorio
terminal, y este penetra la cutícula directamente, constituyendo las hifas
infectivas que colonizan intracelularmente (Tamba, 2014).
Solanum unilobum como fuente de resistencia
Según
Lobo te al. (2000), esta especie presenta resistencia a antracnosis en
comparación con las especies de S. Betaceum y S. Materna, por lo que tiene alta
probabilidad de que existan genes de resistencia hacia antracnosis. Esto permite
enriquecer la variabilidad de las poblaciones de tomate de árbol por el medio
de hibridación, ya que la mayor parte de las tazas de Solanum exhiben auto
compatibilidad para formación de semillas que sean viables con hibridación
interespecífica.
Clima: Se adapta en zonas templadas a templadas frías del
callejón interandino, con un rango de temperatura al año de 14 a 20 grados C y
de 75% a 87% de humedad relativa al año por lo que el clima templado es el
mejor para su adaptabilidad y el requerimiento hídrico de precipitación anual es de 1200 mm (León et al., 2004).
V.
Método de mejoramiento
El método de
multilíneal fue propuesta por Harlan et al. (1975), con el fin de reunir
características de diferentes progenitores en una sola población, sometida a
selección natural en la región de adaptación durante varias generaciones.
Para
crear líneas individuales que entran en la variedad multilineal, se efectúa
cruzamientos entre S. unilobum y S. betaceum para recuperar
características agronómicas deseables y conservar los genes de resistencia,
esta progenie tiene 50 % de su constitución genética como el progenitor
recurrente. Se hace la primera retrocruza RC1 con el progenitor recurrente y se
obtiene segregación del locus A de interés; esta progenie resultante
tiene 75 % de su constitución genética, debido a la dominancia los genotipos no son distinguibles
fenotípicamente, entonces, se hace una autofecundación a cada planta para poder
obtener el genotipo de interés, las que
poseen el genotipo deseado, se seleccionan esas plantas y se hace la retrocruza
RC2,la progenie resultante tiene 87.5 % de su constitución genética como el
progenitor recurrente, se repite
el procedimiento hasta aproximadamente RC5, donde se consigue la línea que
tiene las características adaptativas y agronómicas del progenitor recurrente,
y además el gen de interés. Las líneas a mezclar se obtienen por
retrocruzamientos paralelos que deberían ser teóricamente isogénicas. Tres
grupos de segregantes (retrocruza con S. betaceum) mismos que fueron agrupados
en función de características físicas que constituyen materiales promisorios. En
la figura 1 se presenta el esquema de mejoramiento propuesto.
Figura 1. Esquema de mejoramiento por el
método multilineal
VI. Evaluación
Para
realizar la evaluación en los frutos de 105 plantas segregantes de tomate de
árbol, se somete a presión del patógeno para seleccionar las plantas
resistentes a antracnosis, utilizando como testigo la variedad gigante
anaranjado. Se evalúa los frutos de los segregantes cada 15 días (a cada
cosecha). El hongo se aísla de frutos
de tomate de árbol infestados con Colletotrichum acuatum, se cultiva en PDA por
7 días a 21 °C. Al momento de la inoculación, se toma 5 frutos de cada
segregante, se debe rociar el hongo en la zona ecuatorial del fruto y
posteriormente se procede a realizar una herida con alguna herramienta cortopunzante.
Los frutos inoculados se colocan en cámara húmeda, a 26 °C y con humedad
relativa del 28% con el fin de simular las condiciones idóneas para el
patógeno.
Variables
a evaluar:
Incidencia: en
base a este dato se puede evaluar los daños económicos que produce la
enfermedad en el cultivo y es un aspecto útil para establecer la diseminación
de la enfermedad. Severidad: según (Sandoval T., 2014) se ha determinado que el
grado de asociación entre el porcentaje de frutos infectados y la severidad,
resulta en una relación positiva y directa, es decir, a mayor número de frutos
infectados por árbol mayor es el porcentaje de infección por fruto. Tamaño
de la lesión: según (Sandoval T., 2014) se ha determinado que el
coeficiente de correlación entre tamaño de lesión y severidad es altamente
significativo, es decir, a mayor tamaño de lesión, mayor severidad.
Análisis molecular de los grupos de interés.
El ADN genómico total se aísla de hojas congeladas
utilizando el protocolo descrito por (Dellaporta, Wood,
& Hicks, 1983), es conveniente que el tampón de extracción se
suplemente con 1% de polyvinilpirrolidona para eliminar polifenoles (Lodhi, Ye, Weeden,
& Reisch, 1994). De este modo, El ADN genómico se digiere con dos
enzimas de restricción: MseI y EcoRI, se utiliza dos adaptadores diferentes de
doble cadena, diseñados para evitar la reconstrucción de estos sitios de
restricción, uno para el extremo cohesivo EcoRI y otro para el extremo cohesivo
MseI. Los fragmentos de ADN digeridos y ligados se diluyen 5 veces para ser
usados como molde en la reacción de pre-amplificación, donde se amplifican solo
1/16 de los fragmentos de restricción generados, a continuación, se realiza la
reacción PCR y la amplificación en el termociclador. Al concluir la
amplificación selectiva, las muestras se desnaturalizan añadiéndoles un volumen
igual de tampón formamida calentándolas durante 3 minutos a 94 ºC, tres
microlitros de cada muestra se cargan en geles al 4.5 % de acrilamida/
bisacrilamida (19:1), `para luego exponerlos empleando autoradiografías con el
fin de, tras su revelado visualizar los fragmentos de ADN amplificados y
separados electroforéticamente.
Materiales
promisorios
Siendo:
T= número tratamiento (tomate de árbol segregante) gt= grupo de segregante p=
número de planta dentro del grupo de segregante. Se selecciona como materiales
promisorios para el fitomejoramiento a
aquellos que presentan genes de interés.
Gt10p2: Diámetro ecuatorial
0,49 (cm) Diámetro longitudinal 0,42 (cm) Incidencia 36,67 %. Gt10p5: Diámetro
ecuatorial 0,43 (cm) Diámetro longitudinal 0,38 (cm) Incidencia 46,67 %. En
ambos casos, la incidencia es menor del 50% y los tamaños de lesiones son
bajos. Gt7p10): Diámetro ecuatorial 0,79 (cm) Diámetro longitudinal 0,72 (cm)
Incidencia 66,67 %.; Gt10p25: Diámetro ecuatorial 0,93 (cm) Diámetro
longitudinal 0,92 (cm) Incidencia 80,00 %.; Gt15p11: Diámetro ecuatorial 0,93
(cm) Diámetro longitudinal 0,94 (cm) Incidencia 80,00 %. En esto casos, a pesar
de que son valores que superan el 50% de incidencia, los valores de tamaños de
lesión no son muy altos.
Propagación in
vitro (cultivo de meristemas)
Para conservar las características deseadas en la fase final
de mejoramiento, se empleara la propagación clonal por cultivo in vitro. Este
método evita la contaminación con patógenos además se obtiene una gran cantidad
de individuos en espacios reducidos, de manera uniforme. El cultivo de
meristemas debido a que estas células tienen capacidad de división y se
caracterizan por mantenerse siempre jóvenes y poco diferenciadas (Lozada, 2010).
Conclusiones
Se
determinó un mejoramiento genético en base a los segregantes provenientes del
híbrido simple de tomate de árbol (Solanum
unilobum Cav.) destinado a la resistencia a Antacnosis (Colletotrichum) con ayuda de los
conocimientos impartidos por el docente de catedra y el reforzamiento del mismo
a través de la literatura.
Se realizaron 5 retrocruzas donde la
RC5 se obtuvo la línea que tiene las características adaptativas y agronómicas
(96.87 % de genes del recurrente) del progenitor recurrente, y además el gen de
interés.
Se formaron tres grupos de
segregantes (retrocruza con S. betaceum), fueron agrupados en función de sus características
físicas (gt7p10) el cual presenta una característica de incidencia antracnosis
que va desde 66,67% los segregantes gt10p2 y el gt10p5 con incidencias de
36,67% y 46,67% respectivamente el segregante gt10p25 y el segregante
gt15p11-2, presentan una respuesta de baja susceptibilidad a la enfermedad de
antracnosis, por lo cual constituye materiales promisorios.
La propagación de tomate de árbol se dificulta por la alta variabilidad
de los segregantes, por lo cual se propone realizar la propagación in vitro ya
que con esto se mantiene las características deseadas, aunque esto significa un
aumento en los costos por instalaciones y por la contratación de personal
calificado, este trabajo es necesario para el desarrollo del sector
·
REFERENCIAS
