Obtención de híbridos triples, con cruzamientos de (Vasconcellea parviflora ×

Vasconcellea quercifolia) × (Vasconcellea pubencens) mediante haploidización.

Obtaining triple hybrids, with crosses of (Vasconcellea parviflora × Vasconcellea quercifolia) ×

(Vasconcellea pubencens) through haploidization.

Daniela Nicole Ramirez Silva ¹, Amanda Raquel Rosero Mena ², Danny Marco Suasnavas Chicaiza ³, Lisette Stefanía Vinces Barba ⁴.

^{1, 2,3 4} UCE, Cátedra de Genotecnia Vegetal, Ecuador

RESUMEN

El término calidad se define como el grado de excelencia de un producto. En el contexto de la genética vegetal, el mejoramiento de la calidad significa mejorar los rasgos inherentes a un cultivo que son independientes del rendimiento. Por lo tanto, la calidad incluye el sabor, la nutrición, la apariencia y el procesamiento poscosecha. Para mejorar estos rasgos se han utilizado métodos de mejoramiento tradicional los cuales representan un proceso costoso y de largo plazo, tomando en cuenta esa limitante, en este proyecto de mejoramiento se busca obtener híbridos triples a través del cultivo de anteras el cual nos permitirá alcanzar rápidamente la homogocidad. Para la obtención de este híbrido se realizará un cruzamiento de un híbrido simple (progenitor femenino) obtenido de V. quercifolia x V. parviflora por una línea pura (progenitor masculino) de V. pubescens que darán origen a una variedad con características externas (tamaño) y organolépticas (sabor) ideales para satisfacer la expectativa del consumidor y generar diferenciación del producto en el punto de venta.

Palabras clave: Calidad, cultivo de anteras, V. pubescens

INTRODUCCIÓN

El chamburo (Vasconcellea pubescens) es una planta frutal que ha cobrado cada vez más importancia en América del Sur, especialmente en Chile (Badillo, 2000). Esta especie se encuentra en regiones tropicales, principalmente en América del Sur, en altitudes superiores a los 1500 m.s.n.m., y es originaria de los Andes ecuatorianos. Esta especie en Ecuador representa un recurso fitogenético de gran importancia medicinal, nutricional y agroindustrial, por esta razón es valorada entre las poblaciones rurales del país, no obstante, se encuentra como vegetación nativa o en huertos familiares de modo que no es considerada como un cultivo comercial, por lo tanto, está en peligro de extinción (de la Torre et al., 2008).

El consumo de esta fruta se mantiene bajo y estable en aproximadamente 60 libras per cápita por año. El desafío para los agricultores es capturar el interés de los consumidores de chamburo y la forma adecuada de llegar a esta tarea es ofrecer productos de buena calidad de forma constante. Generalmente, los rasgos de interés por parte del consumidor son la apariencia externa (tamaño, forma), la textura y el sabor de la fruta.

Tomando en cuenta aquellos rasgos de interés por parte del consumidor la introducción de nuevos cultivares de chamburo con mejores características externas como incremento del tamaño y contenido de azúcar del fruto sería uno de los puntos ideales para satisfacer la expectativa del consumidor y generar diferenciación del producto en el punto de venta. Para lograr este objetivo el mejoramiento tradicional es una de las principales estrategias utilizadas para mejorar ciertos rangos de calidad; sin embargo, este tipo de mejoramiento es un proceso costoso y de largo plazo. Una forma de superar este problema es mediante el uso de herramientas biotecnológicas para generar líneas haploides y doble haploides (Forster et al., 2007). Actualmente, los métodos más efectivos para obtener materiales haploides y doble haploides son los cultivos in vitro de anteras o microsporas aisladas (llamado androgénesis), y menos comúnmente, el cultivo de ovario (ginogénesis). Alcanzar rápidamente la homogocidad constituye una de las aplicaciones más importantes del cultivo de anteras en el desarrollo de variedades nuevas porque, gracias a él, el tiempo, el espacio y los costos necesarios para desarrollar las líneas “verdaderamente mejoradas” disminuirán considerablemente (Roca et al., 1991)

Esta técnica de mejoramiento ya ha sido desarrollada en otros cultivos de interés agrícola, así es que en Francia desarrollaron una variedad de trigo “Florin” en la cual se emplearon cerca de 50 000 anteras que fueron plaquedas de un cruzamiento F1 hecho en 1978; de ellas, el 0.13% se regeneró como plantas verdes (9 autodiploides y 55 haploides). De 41 haploides duplicados inducidos por la colchicina se seleccionaron 18 líneas R3 en 1980, y después de cuatro años de pruebas de campo y pruebas oficiales, se registraron, en 1985, dos líneas como variedades. Así pues, solo pasaron siete años entre el cruzamiento F1 inicial y el registro oficial como variedades de estas líneas procedentes del cultivo de anteras (De Buyser et al., 1987).

OBJETIVO GENERAL

 

-      Formar un hibrido triple entre (V.parviflora × V. quercifolia) × (V. pubencens) para obtener un genotipo de menor altura de planta, mayor tamaño y elevado contenido de grados Brix en el fruto, logrando complacer al agricultor y satisfacer las exigencias del mercado nacional, y sus respectivos consumidores.

 

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 

-      Elegir los progenitores adecuados que aporten características de menor tamaño de planta, mayor contenido de grados Brix y tamaño al fruto de V. pubencens

 

-      Evaluar los cruzamientos de los progenitores (V. parviflora × V. quercifolia) × (V. pubencens) que le darán las características deseadas.

 

-      Comprobar que las técnicas biotecnológicas como el cultivo de anteras permiten la fijación inmediata de la homocigosidad lo que nos permite obtener variedades en un menor tiempo posible.

 

-      Obtener una variedad con mayor apreciación tanto al productor como al consumidor y así potenciar su comercialización.

HIPÓTESIS

H0: La formación de un hibrido triple entre (V. parviflora × V. quercifolia) × V. pubencens cumple con el objetivo para crear un genotipo de menor tamaño de planta, mayor tamaño de fruto y mayor grados Brix.

H1: La formación de un hibrido triple entre (V. parviflora × V. quercifolia) × V. pubencens no cumple con el objetivo para crear un genotipo de menor tamaño de planta, mayor tamaño de fruto y mayor grados Brix.

 

 

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

A pesar de que V. pubescens contiene buenos valores nutricionales este frutal no es apreciado en el mercado nacional, pues las primeras características que toma en cuenta el consumidor al momento de comprar una fruta es la apariencia (tamaño, textura) y el sabor, características que no sobresalen en V. pubescens, es por ello que el desafío para los agricultores es capturar el interés de los consumidores y la forma adecuada de llegar a esta tarea es crear variedades con una calidad de fruta adecuada a las exigencias del mercado, y que sean capaces de adaptarse con altos rendimientos a zonas con condiciones climatológicas adversas para el cultivo .

 

 

MARCO TEÓRICO

Características generales de V. pubescens

La familia Caricaceae incluye seis géneros y treinta y cinco especies. Entre ellos, V. pubescens, también llamada papaya de montaña o papayuela en Colombia, y chamburo en Ecuador (de la Torre et al., 2008). Es un cultivo tropical originario de los Andes ecuatorianos, distribuido en altitudes elevadas (por encima de los 1500 msnm) (Consejo Nacional de Investigaciones, 1989). Se introdujo en Chile hace unos 60 años y gradualmente se convirtió en un importante cultivo comercial en el centro-sur de Chile (Badillo V. , 2000). Por lo general, es utilizado para el procesamiento de frutas en conserva, jugos, mermeladas y dulces. Además, las plantas de V. pubescens producen látex con un alto nivel de papaína, una enzima proteolítica importante y valiosa que se utiliza en las industrias de la salud y cosmética, y también tiene otras aplicaciones en el suavizado de textiles, seda y cuero; como ablandador de carne; y en la producción de cerveza (Carrasco et al., 2014).

V. pubescens es una especie diploide compuesta por nueve pares de cromosomas (2n=2x=18), es una planta arborescente con una altura de 2-4 m, pero puede llegar incluso a 10 m, posee polinización abierta en la que normalmente se pueden distinguir tres tipos de flores: femeninas, masculinas y hermafroditas (Badillo, 2000; Kiger, 1986a). Ha sido una práctica tradicional que los cultivadores produzcan su propio material de plantación a partir de sus propios huertos. Durante este proceso los cultivadores eligen las mejores plantas para recolectar frutos y recuperar semillas para producir plántulas (Kiger, 1986b)

El fruto es de color amarillo brillante, con forma ovoide de 7–10 cm de largo por 3–6 cm de diámetro poseen cinco lóbulos que se corresponden con los cinco carpelos del ovario, y peso promedio de 200 g (Gaete et al., 2009). Como en muchas frutas y vegetales, los componentes antioxidantes de V. pubescens se sospecha que juega un papel importante contra la proliferación de células cancerígenas.

Base Genética

El genoma del cloroplasto es una parte integral de los genomas de las plantas lo que contribuye a la adaptación, diversificación y evolución de los linajes de estas. La secuenciación y ensamblaje del genoma del cloroplasto de

V. pubescens se determinó mediante la utilización de la tecnología Oxford Nanopore, concluyendo que el tamaño del genoma es de 158.712 pb, menor que los 160.100 pb del genoma del cloroplasto de C. papaya, en el cual se identificaron dos haplotipos estructurales similares en el genoma de V. pubescens y C. papaya (Lin, Zhou, & Ma, 2020).

Según Vázquez (2014) en su investigación afirma que las mutaciones en la inserción-deleción pueden desempeñar un papel importante en la evolución del gen, donde el gen Ycf2 es el único seleccionado positivamente, además determinaron que el genoma de V. pubescens contiene 131 genes incluidos 82 genes que codifican proteínas, 2 pseudogenes (Ycf1* yInfA*), 8 genes de ARNr y 37 de ARNt, los tamaños de la región LSC y la región SSC son 87991 pb y 17841 pb, respectivamente, separados por dos regiones IR. Determinando que 15 genes que codifican proteínas tienen intrones, de los cuales 11 genes tienen un intrón y cuatro genes tienen dos intrones, similitud encontrada en el genoma del cloroplasto de C. papaya (Vázquez, Zavala, & Sánchez, 2014).

Mapeo de genes

El mapeo genético descrito a continuación muestra las líneas gruesas las misma que indican la extensión de las regiones repetidas invertidas (IRa e IRb), que separan el genoma en regiones de copia única pequeñas (SSC) y grandes (LSC). Los genes dibujados dentro del círculo se transcriben en el sentido de las agujas del reloj y los que están fuera se transcriben en el sentido contrario a las agujas del reloj, tomando en consideración que los diferentes colores representan distintos grupos funcionales de gene (Lin, Zhou, & Ma, 2020)

 

Figura 1. Mapa genético de la V. pubescens.

Autor: Lin, Zhou, & Ma (2020).

Obtenido de: https://www.nature.com/articles/s41598-020-72769-y#citeas

Genes que controlan la característica de interés

V. pubescens junto con C. papaya, son las especies más estudiadas de la familia Caricacea compartiendo en su mayoría rasgos genéticos de importancia agronómica que determinan su aceptación por el consumidor y prioritarios en el mejoramiento genético de estas especies (Peña, Villena, Aguirre, & Jiménez, 2017).

Para la determinación de los genes que controlan la forma, tamaño y color de pulpa se emplearon marcadores moleculares para tipo sexual, color de la pulpa y ocho QTLs asociados a características morfológicas del fruto en una población segregante de papaya derivada de la cruza entre un genotipo silvestre x uno comercial (var. Maradol). Los marcadores QTLs asociados a la morfología del fruto tales como: P3K1700CC, ctg-43C0, CPM1556C0 y P3K4311bK0 para peso, P3K6372CC y P6K969CC para longitud, CPM1550C0 para diámetro y P3K2426aK3 para forma (Vázquez, Zavala, & Sánchez, 2014).

Mejora de chamburo

El mejoramiento genético relacionado con V. pubescens se remonta al cruzamiento para formar un hibrido simple interespecífico efectuado de forma natural (Badillo V. M., 1967). Los intentos de cruzamiento para la formación de híbridos simples interespecíficos manipulada por humanos relacionado con V. pubescens fueron para incorporar a C. papaya resistencia al virus de la mancha anular de la papaya (PRV), en un principio sin obtener resultados óptimos de hibridación (Zee, 1985). Los registros óptimos de un hibrido interespecífico de papaya y chamburo se logró por Manshardt & Wenslaff (1989) al recuperar híbridos por medio de cultivos in vitro al cultivar óvulos jóvenes de 30 a 45 días después de la polinización entre las dos especies antes mencionadas.

Mas adelante, en Australia se intentó incorporar resistencia a varias enfermedades, así como características agronómicas importantes a papaya, donde se intenta obtener híbridos interespecíficos al cruzar varias especies de Caricaceaes, además de las diferentes cruzas es el primer estudio en donde obtiene híbridos de V. pubecens y a V. goudotiana que fueron difíciles de establecer en macetas, sin embargo, las que sobrevivieron crecieron vigorosamente en el campo pero eran propensas a la pudrición de las raíces. Los árboles sobrevivientes crecieron bien durante toda la temporada y se produjeron tanto árboles masculinos como femeninos (Drew, Magdalita, & O'Brien, 1997)

De acuerdo con Siar, Drew, Razali, & Villegas (2010) logra transferir resistencia al virus de la mancha anular de la papaya (PRSV-P) después de 50 años de varios intentos, en donde se utilizó V. pubescens para transferir sus genes de resistencia al virus. De esta forma se evidencia que los estudios de mejoramiento genético relacionado con V. pubescens funciona como donante de genes de resistencia (Kanchana-udomkan, Nantawan, Drew, & Ford, 2017).

Método de mejoramiento del chamburo

El método de híbridos triples juega un papel esencial en los programas de mejoramiento genético enfocado en la hibridación considerando un gran ahorro de tiempo y esfuerzo para el mejorador, así como también se logra conocer el comportamiento del hibrido y la combinación de los progenitores (Maro, 2004).

El cultivo de anteras (CA) es una técnica que permite la obtención de plantas diploides directamente del grano de polen, que permite iniciar con la proliferación de un tejido no diferenciado llamado callo a partir del cultivo in vitro y culmina con la formación de embriones o plantas regeneradas (Balcazar, 2016)

La utilización de la técnica del cultivo in vitro de anteras puede permitir la obtención de líneas haploides y dobles haploides en un corto tiempo, evitando las cinco a siete generaciones de autofecundación necesarias en caso de emplear el método natural de endogamia. El cultivo de anteras es considerado el método más eficiente de producción de plantas doble haploides (Chong-Pérez et al., 2018; Lassaga et al., 2010)

MATERIALES Y MÉTODOS

Ubicación de la obtención del material parental

El proceso comenzará con el cruzamiento de un híbrido simple (progenitor femenino) por una línea pura (progenitor masculino).

El híbrido simple que será empleado en este proyecto provendrá de la cruza de V. quercifolia x V. parviflora.

La obtención de material vegetal de V. quercifolia se realizará en la provincia de Loja, cantón Macará en la Reserva Natural Laipuna, cuya ubicación geográfica es 4°16'08.3"Sur y °54'09.7"Oeste a 1400 m.s.n.m. El material de V. parviflora se recolectará en la provincia de Loja, cantón Puyango, en la propiedad del señor Franklin Granillo, cuya ubicación geográfica es 3°53'38.3"Sur y 80°05'12.5"Oeste a 900 m.s.n.m.

El material de V. pubescens como progenitor masculino se recolectará en la provincia del Carchi, cantón Montufar, cuyas coordenadas geográficas 0°33'57.5"Norte y 77°46'21.3"Oeste, y comprende una altitud desde los 1200 msnm en la zona del Valle del Chota, hasta los 3000 msnm, y la provincia de Imbabura.

Ubicación en fase de laboratorio

El método de cultivo de anteras (Androgénesis) se implementará con la finalidad de reducir el tiempo de evaluación del ensayo, este método se realizará en el laboratorio de Genotecnia Vegetal ubicado en el Centro Académico Docente Experimental “La Tola” (CADET) en la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador en la localidad La Morita, parroquia Tumbaco a 0°13'45.3"Sur 78°22'19.2"Oeste en el cantón Quito.

Para la ejecución del método mencionado con anterioridad se utilizará material vegetal previamente evaluado y esterilizado que muestren mayor porcentaje de microesporas uninucleadas, las mismas que serán sumergidas durante 4 días en una solución estéril de CuSO ₄ de 500 mg·L ⁻¹ para evitar contaminaciones fúngicas y mejorar la viabilidad de las anteras y posteriormente se esterilizaran en etanol al 70% durante 15 min. Las anteras seleccionadas serán aisladas y colocadas en un recipiente de 54,65 g·L- ^{1 en} una solución de manitol hasta su inoculación en el medio basal de Murashige y Skoog añadiendo diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento, sacarosa (20 g·L- ¹ ) y ajustador de pH (5,8 antes de gelificar). Finalmente se procederá a cultivar diez anteras en frascos de vidrio separados (130 ml de capacidad) con 15 ml de medio de cultivo, los cuales serán preservados en la oscuridad a una temperatura de 25 ± 2°C durante dos meses hasta la formación del callo.

Ubicación fase de campo

Las evaluaciones en campo se realizarán bajo invernadero en las instalaciones del CADET de la Universidad Central del Ecuador, ubicada geográficamente a 0°13'41.3" sur y 78°22'20.3" oeste. El óptimo desarrollo y consiguiente fructificación del cultivar está ligado a las condiciones bajo invernadero que serían a una temperatura promedio de 17°C y humedad relativa promedio de 70% ideales para el material vegetal.

Ubicación fase de evaluación

Se realizará la evaluación de los híbridos obtenidos en campo por 2 a 3 años bajo condiciones de invernadero en tres localidades diferentes, teniendo en cuenta la región Sierra como la zona de mayor concentración de las Vasconcelleas por sus aptas condiciones climáticas siendo las provincias de Loja, Azuay e Imbabura.

Cahuasquí, ubicado en la provincia de Imbabura a 2,192 m.s.n.m. y cuya ubicación geográfica es 0°31'0" norte y 78°13'60" oeste. Esta parroquia presenta un clima templado propio de un valle con una temperatura promedio anual de 17.4°C, y con un suelo franco arcilloso óptimo para la retención de humedad y desarrollo del cultivo.

Zapotillo, ubicado en la provincia de Loja a 325 m.s.n.m. y cuya ubicación geográfica es 4°23′11″ sur y 80°14′37″ oeste. Esta parroquia presenta un clima tropical con una temperatura promedio anual de 26°C ideal para el desarrollo del cultivo teniendo en cuenta que es originario de esta zona.

Chiquintad, ubicado en la provincia de Azuay a 2700 m.s.n.m. y cuya ubicación geográfica es 2°49'0" sur y 79°0'0" oeste. Esta parroquia presenta un clima templado con una temperatura promedio anual de 15°C y con un suelo arcillo-arenoso con aptas condiciones para el cultivo siendo fértiles y fáciles de trabajar.