Análisis proteómico comparativo de la respuesta a la sequía y a las altas temperaturas en las raíces de dos cultivares de papa

Dominika BoguszewskaMańkowska ¹, Marta Gietler ², Małgorzata Nykiel²  

 

Resumen: Un análisis de los rasgos morfológicos, fisiológicos y relacionados con el proteoma de la raíz demostró que la escasez de agua y las altas temperaturas provocan la deshidratación de las plantas y la respuesta a esos estreses en el proteoma. Un análisis comparativo de proteínas que responden a estas condiciones y facilita información sobre el mecanismo molecular de la tolerancia al estrés de la papa, que difieren en tolerancia a la deshidratación y estos se compararon. La identificación de proteínas LC-MS/MS mostró qué en las raíces del cultivar sensible, la mayoría de los cambios se refieren a una mayor abundancia de proteínas relacionadas con la defensa y la desintoxicación, mientras que, en plantas se observaron cambios significativos en la abundancia de energía y proteínas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos. 
Palabras clave: Proteoma, Deshidratación, Tolerancia.  

 

1. Introducción 

La papa es considerada una especie de cultivo muy sensible a la sequía y a las altas temperaturas incluso con niveles moderados de déficit de humedad del suelo, se observan reducciones en el rendimiento y esto es resultado de la disminución en el número, tamaño y calidad de los tubérculos. El cambio climático está asociado con el aumento de temperatura y la reducción de las precipitaciones y esto provoca efectos negativos en la planta. Las altas temperaturas retrasan la iniciación y el engrosamiento de los tubérculos y esto provoca trastornos de calidad como malformaciones y necrosis de los tubérculos (Levy & Veilleux, 2007). 

 

     De acuerdo con Binod et al, 2015 las características morfológicas y fisiológicas de las raíces están relacionadas con la resistencia a la sequía de las plantas ya que la papa posee un sistema radicular superficial que hace su alta dependencia de la regularidad de las lluvias y su sensibilidad a la escasez periódica de agua. Se estima que la producción mundial de papa está en los 377 millones de toneladas en un área de 19 millones de hectáreas, sin embargo, la escasez de agua puede provocar una reducción del rendimiento de la papa hasta un 79%. Ahora con los cambios climáticos se calcula que el rendimiento de la papa disminuirá en un 18% y un 32% en todo el mundo entre los años del 2040 y 2069 (Ahn et al, 2004). 

 

     Los cultivares sensibles a la sequía se mantuvieron en la misma longitud, la alta temperatura (30°C) redujo el tamaño del sistema de raíces en papa tolerante y sensible al calor clones. Se han encontrado diferencias genotípicas significativas en las respuestas de las raíces de las plantas de papa a las altas temperaturas. Las consecuencias de la sequía del suelo y las altas temperaturas son tensiones osmóticas y oxidativas en las plantas (Joshi et al, 2016). Se han desarrollado técnicas de alto rendimiento lo que permite comprender los mecanismos implicados en la regulación de los rasgos deseables. Estos experimentos sobre diferencias de transcriptosomas entre dos pares seleccionado de papa relacionados entre sí y que difieren en la tolerancia a la sequía, permitieron la identificación de genes que responde a la sequía (Chaves et al, 2003). 

 

2. Materiales y métodos

El experimento se realizó en el Instituto Nacional de Investigación de Fitomejoramiento y Aclimatación, durante dos temporadas de vegetación desde el 25 de Abril al 10 de septiembre. Dos cultivares de papa polacos, el Gwiazda tolerante a la sequía y el Oberón sensible a la sequía, ambos se originaron en la Estación de Cría Zamarte en Polonia, las plantas se cultivaron en una sala de vegetación en 14 dm3 Ollas relleno con una fina capa de grava en el fondo y 12 dm3.  

Estado del agua de la planta 

Las hojas maduras y completamente expandidas del tercer nivel de la parte superior de la planta, de tamaño comparable, se tomaron muestras para evaluar el contenido relativo de agua (RWC). 

Medidas morfológicas 

El área de asimilación de las hojas estaba determinada utilizando un medidor de área LI-3100A después del final de la sequía o del período de alta temperatura. Las mediciones se realizaron en tres repeticiones. Se evaluó la masa seca de hojas, tallos y raíces en un secado en dos etapas de 24 h a 75 °C y 105 °C hasta constante se obtuvo el peso. 

Mediciones de fluorescencia de la clorofila 

La cinética de la fluorescencia de la clorofila se midió en la parte media de las hojas apicales completamente expandidas y maduras de plantas de papa de tercer y cuarto nivel después de 14 días de estrés aplicación en cada combinación (control, sequía y alta temperatura). 

La fluorescencia de la clorofila se tomó con el Analizador de eficiencia de plantas multifuncional y analizados con el software Pea Plus. antes de midiendo, las plantas se adaptaron a la oscuridad al menos durante 30 min. 

Medidas de la actividad enzimática antioxidante 

La actividad del superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1, SOD) fue medido según Kostyuk y Potapovich (1989). La reacción se inició añadiendo 0,1 cm3 de Quercetina 2,5 μM en DMSO. Se midió la absorbancia a 406 nm inmediatamente y después de 20 min de reacción. La actividad de catalasa (EC 1.11.1.6, CAT) se midió de acuerdo con el método basado en Beers and Sizer (1952). La absorbancia a 240 nm se midió inmediatamente después de agregar 0,1 cm3 de sobrenadante, y la disminución de la absorbancia fue registrado cada 30 s durante 4 min. Se utilizó el coeficiente de extinción de H2O2 43,6 M − 1 cm − 1 para calcular la actividad CAT. La actividad enzimática se expresó en micromoles de H2O2 por minuto por mg de proteína. Actividad de peroxidasa tipo guayacol (EC 1.11.1.7, GPOX) se estimó según Chance y Maehly (1955). 

Preparación de muestras para análisis 2-DE 

Para los análisis proteómicos, tres muestras de cada combinación del experimento (n = 3 réplicas biológicas) fueron cosechado. Aproximadamente 500 mg de material de raíz de papa 

Se extrajeron proteínas totales para cada uno de los tres replica según Wang et al. método (2006). El contenido de proteína se determinó según el método de Bradford (1976) con albúmina sérica (BSA) como estándar. Página 2D IEF / SDS los geles 2DE se realizaron de acuerdo con Gietler et al. (2017). 

3. Resultados

Respuestas morfo-fisiológicas de las plantas de papa a la sequía o las altas temperaturas del suelo 

Se suspendió el agua por 14 días a las plantas de papa estando en la tercera semana de la fase de tuberización, dando como resultado en una disminución significativa en el contenido de agua en las hojas medido como RWC (contenido relativo de agua en%) en ambos cultivares examinados (Tabla 1). La comparación de RWC en plantas de control que crecen en condiciones óptimas de ambos cultivares no mostró diferencias significativas. Al final de la sequía del suelo, el RWC disminuyó aproximadamente un 40% en el cultivar Gwiazda y un 50% en el cultivar Oberon. 

Como era de esperar, se observó un fuerte fenotipo de marchitamiento en el cultivar Oberon. La observación fenotípica en ambos cultivares apoyó el hallazgo anterior (Boguszewska-Mańkowska et al. 2018) que la estrategia de evitación de la resistencia a la sequía está mejor desarrollada en el cultivar Gwiazda.  

      En los cultivares investigados, el rendimiento de tubérculos se vio más afectado por la sequía aplicada al suelo que por el tratamiento a alta temperatura (Tabla 1). En respuesta a la sequía del suelo, la producción de tubérculos de papa se redujo en un 8,4% en el cultivar Gwiazda y en un 44% en Oberon. 

Tabla 1. Cambios en el contenido relativo de agua de la hoja (RWC en%), el área de asimilación foliar (LAA) y el rendimiento de hojas, tubérculos, tallo y raíz de la masa seca de dos cultivares de papa que crecen en condiciones óptimas (C), sometidos a 14 días de sequía del suelo (D) o alta temperatura (HT).  

Cultivar	Tratamiento	RWC (%)	Área de asimilación de hojas (cm2)	Masa fresca (g)  Rendimiento de tubérculos	Masa seca (g)
					Hoja	Vástago	Raíz
Gwiazda	C	89,5a	7990a	1363a	52.46a	48.30ab	1.31b
	re	53,7c	2249e	1249ab	32,8c	39,34c	1.11c
	HT	88,0 ab	5544c	1289ab	41,7b	50.45a	1.25bc
Oberon	C	90,5a	6568b	1314ab	39.09b	40.06c	1,69a
	re	41,5d	1533f	739c	23.20d	30.85d	1.00d
	HT	82,1b	3668d	1105d	30,46c	38,5c	1,64a
Significación estadística (Pr> F)a
Tratamiento (D, HT)		**	**	**	**	**	**
Cultivar (C)		**	**	**	**	**	**
C x D x HT		**	**	**	**	**	**

Las letras (a – e) denotan la significancia estadística (prueba HSD de Tukey) de las diferencias entre el cultivo / tratamiento de estrés ^a_* , _** indican significancia p = 0.05 y 0.01 

     Se observó una tendencia similar en respuesta a la alta temperatura, donde las pérdidas de rendimiento alcanzaron aproximadamente el 5% en el cultivar Gwiazda y el 16% en Oberon (Boguszewska-Mańkowska et al. 2018; Pieczyński et al. 2018). El cultivar Gwiazda también es más tolerante a las altas temperaturas, en comparación con el cultivar Oberon. El cultivar tolerante a la sequía Gwiazda desarrolló un área foliar más alta que el cultivar Oberon (Tabla 1). El tratamiento de sequía redujo el área de asimilación de las hojas más que las altas temperaturas dejando un 77% y un 72% en Oberon y Gwiazda, respectivamente.  

Análisis de proteínas diferencialmente abundantes (DAP) en el proteoma de la raíz en condiciones de sequía o altas temperaturas  

La exposición de la papa a la sequía del suelo o las altas temperaturas resultó en un cambio en la presencia de algunas proteínas en las raíces de la papa. Había 18 puntos que diferenciaban el control y las raíces estresadas por la sequía del cultivar tolerante y 13 puntos que diferencian el control y las raíces estresadas por sequía del cultivar sensible.  En las raíces de Gwiazda (tolerantes), las proteínas se asocian principalmente con el metabolismo de la energía y los carbohidratos y con los procesos de defensa / desintoxicación. Sin embargo, la proporción de proteínas diferenciales involucradas en la defensa y la desintoxicación en el cultivar sensible (Oberon) fue casi dos veces mayor que en las plantas tolerantes y aproximadamente dos veces menor en energía y metabolismo de carbohidratos.  

     La alta temperatura cambió la proporción de proteínas involucrado en la síntesis de la pared celular que fue del 15% en el cultivar tolerante. No se produjo un cambio similar en el genotipo sensible. Las diferencias son visibles en el porcentaje de proteínas involucradas en el metabolismo de aminoácidos y nucleicos (6% en respuesta a sequía y 14% en respuesta a alta temperatura) y en proteínas de la pared celular (23% en respuesta a sequía y 10% en respuesta a alta temperatura).

Dinámica de los cambios en los perfiles de proteínas en respuesta a la sequía o las altas temperaturas del suelo. 

Un análisis de componentes principales (PCA) basado en la caracterización del proteoma permite discriminar entre los dos cultivares de papa. El PCA de los mapas de proteomas obtenidos demostró que los perfiles de proteínas en el cultivar tolerante (Gwiazda) han cambiado con el tratamiento de estrés. Los dos primeros componentes del PCA representaron el 60,227% de la variación total de los datos originales, y los tres primeros componentes explicaron el 73,850% de la variación entre las muestras. En comparación con las plantas de control, los brotes tratados con calor y sequía tienen perfiles diferentes según PC1, ambos tipos de estrés tuvieron valores de PC2 similares que difirieron significativamente del valor de PC2 del perfil de las plantas de control.  

Los resultados de PCA sugieren que la respuesta del proteoma de la raíz al estrés está lejos de ser aleatoria, ya que se desarrollaron patrones de proteínas específicas en reacción a la sequía y las altas temperaturas en ambos cultivares. 

 

 

Proteínas comunes y únicas que responden a la sequía y a altas temperaturas 

En el cultivar Gwiazda (tolerante), NAD (P) H deshidrogenasa (quinona) menos abundante y la subunidad catalítica de protón ATPasa tipo V, la proteína RuBisCO de cadena grande y el factor de elongación del caucho aumentaron en abundancia y fueron comunes para ambos estreses por sequía y alta temperatura, mientras que en el cultivar Oberon (sensible), el único DAP común bajo ambos tipos de estrés fue 14–3–3 proteína 10 OS. 

 

Red de interacción funcional de proteínas diferencialmente abundantes 

La predicción de redes funcionales de DAP identificados en suelos sequía y cultivares de papa sensibles y tolerantes a altas temperaturas se realizó utilizando el software STRING. En el cultivar tolerante (Gwiazda) sometido a sequía o alta temperatura del suelo, casi todas las proteínas identificadas involucradas en el metabolismo energético y de carbohidratos eran parte de la red. En el cultivar sensible (Oberon), la red de proteínas de las raíces no era muy extensa después de la sequía del suelo, sin embargo, en plantas del cultivar sensible (Oberon) sometidas a altas temperaturas, la red observada se extendió y consistió en proteínas fuertemente conectadas; hubo una dimisión el metabolismo energético y de los hidratos de carbono cuando se colocó a ambientes desfavorables.   

4. Discusión

 

Los genotipos de papa que poseen raíces largas tienen menos peso seco en brotes y rendimiento comparado con las raíces pequeñas; la deshidratación es ocasionada debido a que el sistema radicular de este cultivo es poco profundo según Deguchi et al (2010), no obstante, Zaryńska et al (2017) demostró que el sistema de raíces más grandes puede reducir las sequías dado que existe una mayor masa fresca en las raíces. El cultivo Oberon obtuvo una fotosíntesis eficaz y redujo los parámetros de prueba JIP resultado de la asimilación foliar activa junto con RWC (Boguszewska et al., 2018); el daño oxidativo demostrado por el contenido de TBARS se debe a que la peroxidación lipídica no se enlazó con el estrés en las raíces de papa, Mittler (2002) afirma que ROS y la activación de enzimas hidrolíticas ayudan a destruir la oxidación de proteínas., ácidos nucleicos y lípidos de membrana. 

 

La abundancia de proteínas involucradas en la síntesis de la pared celular disminuyó con la sequía y las altas temperaturas. 

La absorción minuciosa de agua y el aumento constante de la pared celular para expandir las células y permitir la expansión de las plantas es fundamental, además las pectinas son responsables de disminuir el estés por calor en la pared celular (Piro et al, 2003), la biosíntesis de la celulosa y la lignina se ve afectada si no hay agua. Al reducir cafeoil- CoA3-O- metiltransferasa y aumentar la temperatura se propone tener menos magnitud en la síntesis de lignina en el cultivar tolerante Gwiazda (Bray, 2004).      S-adenosilmetionina interviene en la inhibición por etileno de la expansión y estructuras poliméricas de las raíces de arroz y modificación de la pared celular, es por ello que S- adenosilmetionina sintetasa al estar en condiciones de sal involucra la metilación de monómeros de lignina mucho antes de su polimerización (Guo et al.2014), cabe recalcar que esta enzima hace que la papa sea tolerante a temperaturas altas porque se observó que las raíces eran tolerantes al incremento simultáneo de cafeoil- CoA3-O- metiltransferasa. 

 

Las proteínas involucradas en el metabolismo de los carbohidratos y la producción de energía son abundantes en el cultivar tolerante 

El 33-40% del total de proteínas sensibles a la sequía y al calor se involucran en el metabolismo de carbohidratos y energía del cultivo de papa como la glucólisis, en el cultivar sensible tuvo un 8% de proteínas en condiciones de sequía y altas temperaturas y el 20% en el cultivar tolerante.  Disminución de enzimas glucolíticas, fructosa-bisfosfato aldolasa (mancha 80), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (mancha 82), fosfoglicerato quinasa (mancha 79), piruvato deshidrogenasa (mancha 93) en el cultivar sensible a alta temperatura. En cuanto al cultivar tolerante a alta temperatura las enzimas glucolíticas se redujeron como la fosfoglicerato mutasa (mancha 47) y fructoquinasa (mancha 52).

 

Cambios en la abundancia de proteínas protectoras 

Estos cambios alteraron el sistema de defensa, sobre todo a la desintoxicación reactivas de oxígeno, el cultivar sensible sujeto a sequía, tuvo 76% de DAP para la raíz. Las proteínas reparadoras como la 14-3-3 (manchas 44, 90), subunidad alfa de proteasoma (manchas 46 y 56), proteína de 70 kDa de choque térmico (manchas 20, 33, 84 y 87) aumento de las raíces de la papa debido a la sequía del suelo y las altas temperaturas. En algunos experimentos proteómicos las proteínas 14-3-3 aumentaron en el manejo de sequía en el arroz (Yashvardhini et al, 2018) o Arabidopsis thaliana (Sun et al, 2014); esta investigación prueba que en el cultivar sensible aumentan las proteínas en el tratamiento de sequía y alta temperatura.  

 

     Otra proteína protectora que aumentó en abundancia fue α de la proteasoma en el cultivar sensible bajo sequía (punto 46) y el cultivar tolerante bajo alta temperatura (punto 56). El incremento en la abundancia de proteína de 70 kDa de choque térmico bajo sequía en el cultivar sensible (punto 33) y en el tolerante (punto 20) tiene una amplia gama de funciones celulares como "chaperonas moleculares" y reducción de nivel intracelular de ROS reactivos. La familia Hsps en el cultivar sensible y tolerante indica un mecanismo defensivo común. Las proteínas antioxidantes GPOX (mancha 30), monodehidroascorbato reductasa (mancha 63) y CAT (mancha 34) en cultivares sensibles y resistentes frente a la sequía y las altas temperaturas; cuando sube la concentración de ROS puede ocasionar un daño químico al ADN, lípidos y proteínas (Ford et al. 2011), esto se mejora a través de la activación del sistema de defensa antioxidante como captadores enzimáticos (Boguszewska et al. 2010). 

5. Conclusiones 

La principal discrepancia en la reacción de ambos cultivares a la sequía del suelo y las altas temperaturas se encuentra vinculada a las variaciones en los procedimientos de producción y conservación de energía esto se lo dedujo al compararlos fisiológicamente por los cambios en el proteoma de la raíz.

     En esta investigación se evidencia que las plantas con respecto a la sequía del suelo y las altas temperaturas requieren energía metabólica. Además, las raíces no fotosintetizantes usaron reservas de energía para poder activar enzimas asociadas con los mecanismos de defensa y eliminación de ROS. 

     Las enzimas relacionadas con la glucólisis y la producción de energía se reprimieron en condiciones de sequía o altas temperaturas, es decir que, las plantas al usar las reservas energéticas para luchar contra no pueden activar otros mecanismos de supervivencia, dado que, el uso excesivo de reservas de energía disminuye el rendimiento de tubérculos, obteniendo una menor utilidad del cultivar Oberon. 

     El cultivar Gwiazda presenta una adaptación sutil del metabolismo energético y del sistema de defensa, ya que la conservación de la obtención de energía junto con la activación selectiva simultánea del sistema de control del estrés oxidativo facilita que la planta pueda vivir mucho más. Adicionalmente, permite conservar la energía lo que conlleva a tener una menor reducción del rendimiento de tubérculos de papa. 

Resumido por: Calero, M.P.¹, Galárraga, B ¹, Galarza, A. ¹, Quenguan, X. ¹

¹ Estudiantes Universidad Central del Ecuado

6. Referencias bibliográficas

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